生物素在玻片上使用步骤与注意事项

生物素在玻片上的应用：全面指南（步骤、注意事项与问题解析）

生物素（维生素H）与亲和素/链霉亲和素之间高亲和力的结合，是免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）和原位杂交（ISH）等实验中广泛使用的放大系统核心。无论是检测低丰度蛋白还是进行精细的细胞定位，在玻片上正确使用生物素都至关重要。本文将为您详细解析从实验准备到结果分析的完整流程与关键要点。

一、 核心原理：为什么选择生物素系统？

在深入步骤之前，理解其原理有助于更好地掌控实验。生物素系统的主要优势在于：

• 高效放大信号：一个抗体或探针上可以标记多个生物素分子，而一个链霉亲和素上又能结合多个带有报告分子（如酶、荧光素）的生物素，从而实现信号的级联放大。
• 高亲和力与特异性：生物素与链霉亲和素的结合强度极高，且特异性好，能有效降低背景。
• 灵活性：可与多种检测系统（HRP、AP、荧光）兼容。

二、 标准操作步骤（以免疫组化IHC为例）

以下是在玻片上进行生物素标记实验的典型流程。

1. 实验前准备

• 玻片处理：使用防脱载玻片，必要时进行多聚赖氨酸或APES等处理，防止组织切片在后续频繁冲洗中脱落。
• 组织切片：石蜡切片需经过脱蜡、水化；冰冻切片需固定后恢复至室温。所有步骤均需避免切片干燥。
• 抗原修复：根据目标抗原选择合适的修复方法（热修复或酶修复），以暴露被掩盖的抗原表位。
• 阻断内源性过氧化物酶：如果使用HRP检测系统，需用3% H₂O₂溶液处理以消除组织内的内源性过氧化物酶，避免假阳性。
• 阻断非特异性结合：用与二抗同源的正常血清或3% BSA溶液孵育，封闭组织上电荷吸附位点。

2. 生物素标记与检测流程

1. 一抗孵育：滴加适当稀释度的生物素化的一抗，覆盖组织，在湿盒中于37°C或4°C孵育一定时间。
2. 洗涤：用PBS或TBS缓冲液充分洗涤（通常3次，每次5分钟），去除未结合的一抗。
3. 链霉亲和素-酶/荧光素复合物孵育：滴加预先配制好的链霉亲和素-HRP（或链霉亲和素-AP、链霉亲和素-荧光素）溶液，室温孵育20-30分钟。
4. 再次洗涤：同样用缓冲液充分洗涤，去除未结合的复合物。

3. 信号检测与复染

1. 显色：
   • 酶标系统（HRP）：滴加DAB或其他底物显色液，在显微镜下监控显色程度，及时终止反应（浸入蒸馏水中）。
   • 荧光系统：无需此步，直接进入下一步。
2. 复染：用苏木精（对IHC）或DAPI（对免疫荧光）进行细胞核复染，提供组织形态学参照。
3. 封片：
   • IHC：脱水、透明、用中性树胶封片。
   • 免疫荧光：使用抗荧光淬灭封片剂封片。

三、 关键注意事项与常见问题解析

这是实验成败的核心，请务必牢记。

1. 阻断内源性生物素

• 问题：许多组织（如肝、肾、乳腺、脂肪）富含内源性生物素，会与后续加入的链霉亲和素非特异性结合，导致高背景或假阳性。
• 解决方案：在加入链霉亲和素复合物之前，使用卵白素-生物素阻断试剂盒进行封闭。顺序为：先加卵白素，洗涤后再加生物素，以饱和内源性生物素的结合位点。

2. 避免非特异性背景

• 充分洗涤：每一步孵育后的洗涤必须彻底，这是降低背景最简单有效的方法。
• 优化抗体浓度：一抗和链霉亲和素复合物的浓度过高是背景染色的主要原因。必须进行浓度梯度实验，找到最佳稀释度。
• 使用高质量的封闭血清：确保封闭液的有效性。

3. 对照的设置

• 阴性对照：
  • 空白对照：用PBS代替一抗，用于检测检测系统本身是否有非特异性吸附。
  • 同型对照：使用与一抗同种属、同亚型的无关免疫球蛋白，用于排除抗体的非特异性结合。
• 阳性对照：使用已知阳性的组织切片，确保整个实验流程和试剂有效。

4. 防止切片干燥

• 在整个实验过程中，任何时候都不能让组织切片完全干燥，否则会导致抗体非特异性吸附，造成难以清除的高背景和结晶样沉淀。使用湿盒孵育是关键。

5. 试剂保存与有效期

• 生物素化抗体和链霉亲和素复合物应按照说明书要求保存，通常为4°C或-20°C，避免反复冻融。
• DAB等显色液应避光保存，现用现配，或使用商品化的稳定液。

四、 常见问题与 troubleshooting

• 背景染色过深：
  • 原因：内源性生物素未阻断、一抗/二抗浓度过高、洗涤不充分、切片干燥。
  • 对策：加强内源性生物素阻断、滴定抗体、确保洗涤步骤、保持切片湿润。
• 无特异性信号：
  • 原因：一抗失效、抗原修复不当、试剂添加顺序错误或漏加、显色底物失效。
  • 对策：更换一抗、尝试不同的抗原修复方法、检查实验流程、使用阳性对照验证试剂。
• 染色不均匀：
  • 原因：抗体未完全覆盖组织、孵育时湿盒水汽凝结滴在切片上。
  • 对策：确保抗体液完全覆盖组织，且液滴之间无气泡；确保湿盒水平放置，温度平衡后再放入切片。

总结