生物素与亲和素孵育的四种方法

作者：小编更新时间：2025-11-18

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生物素与亲和素孵育的四种核心方法详解与应用指南

在免疫学、分子生物学和细胞生物学等领域，生物素（biotin）与亲和素（avidin）或链霉亲和素（streptavidin）的结合，因其近乎不可逆的高亲和力（Kd ≈ 10^-15 M），已成为放大信号、提高检测灵敏度的黄金标准。无论是ELISA、Western Blot、免疫组化还是流式细胞术，正确选择孵育方法都至关重要。

当您搜索“生物素与亲和素孵育的四种方法”时，核心需求是希望系统地了解不同操作流程的步骤、优缺点及适用场景，以便为您的实验选择最佳方案。本文将深入解析这四种经典方法，助您攻克实验难关。

生物素

核心原理：为何需要不同的孵育方法？

生物素是一个小分子维生素，可以轻松偶联到抗体、核酸或其他探针上。亲和素/链霉亲和素则是一个四聚体蛋白，能同时结合四个生物素分子。这种多价特性使得我们可以设计出灵活多样的“三明治”式检测方案，主要目的是信号放大和实验流程优化。

四种孵育方法详解

方法一：直接法（一步法）

生物素

这是最简单直接的方法。

操作流程：
1. 将预先偶联了生物素的生物素化一抗（Biotinylated Primary Antibody）直接与样本（如固定在膜上的蛋白、细胞或组织切片）孵育。
2. 洗涤去除未结合的一抗。
3. 加入偶联了报告分子（如酶HRP、荧光素FITC）的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）进行孵育。
4. 再次洗涤后，即可进行检测。
优点：
- 快速简便：步骤少，耗时短。
- 背景低：减少了非特异性结合的机会。
缺点：
- 信号放大有限：由于每个一抗分子上偶联的生物素数量有限，信号放大效果不如间接法。
- 灵活性差：需要购买特定的生物素化一抗。
适用场景：当您已有商品化的生物素化一抗，且检测目标丰度较高时，此方法是高效的选择。

方法二：间接法（两步法）——最常用、信号最强的方法

这是应用最广泛的方法，通过引入一个“桥连”抗体，实现了极强的信号放大。

操作流程：
1. 先用未标记的一抗（Primary Antibody）与样本孵育并洗涤。
2. 再加入生物素化的二抗（Biotinylated Secondary Antibody）（如兔抗小鼠IgG-Biotin）进行孵育并洗涤。此二抗能特异性结合一抗。
3. 最后加入酶或荧光标记的链霉亲和素（Streptavidin-Conjugate）进行孵育和洗涤。
优点：