生物素在玻片上使用步骤与注意事项

作者：小编更新时间：2025-09-25

好的，这是一篇根据您提供的需求点生成的全面解答文章。

---

### **生物素在玻片免疫组化/免疫荧光中的使用指南：步骤与核心注意事项**

在免疫组织化学或免疫荧光实验中，生物素-亲和素系统因其极高的亲和力和信号放大能力而被广泛应用。如果您正在搜索“生物素在玻片上使用步骤与注意事项”，说明您很可能正在筹划或优化相关的实验。本文将为您详细解析从实验准备到结果分析的全流程，并重点强调关键注意事项，助您获得稳定、清晰的实验结果。

#### **一、生物素系统简介**

生物素是一种小分子维生素，与蛋白质（如链霉亲和素或亲和素）具有极强的亲和力。在玻片实验中，我们通常采用以下策略：

1. **一抗**：与目标抗原特异性结合。

2. **生物素标记的二抗**：与一抗的Fc段结合，从而将生物素引入体系。

3. **酶或荧光素标记的链霉亲和素**：与生物素结合，最后通过底物显色（如DAB）或激发荧光来检测信号。

这套系统的核心优势在于**信号放大**，因为一个生物素化的二抗可以结合多个链霉亲和素分子，显著增强微弱信号。

#### **二、详细操作步骤（以石蜡切片为例）**

**前期准备：**

* **玻片处理**：使用防脱载玻片，必要时进行多聚赖氨酸或APES包被，防止组织在复杂流程中脱落。

* **切片**：石蜡切片需经过脱蜡、水化。冰冻切片可直接固定后进入下一步。

* **抗原修复**：根据一抗说明书选择适当的抗原修复方法（热修复或酶修复），以暴露被遮蔽的抗原表位。

* **内源性过氧化物酶/生物素阻断**：**这是关键步骤！**（详见注意事项）

**实验流程：**

1. **阻断**：滴加正常血清（与二抗来源同种属的非免疫血清）或3% BSA，室温孵育20-30分钟。目的是封闭组织中的非特异性结合位点，降低背景。

2. **孵育一抗**：倾去阻断液，勿洗。直接滴加适量稀释好的一抗，确保完全覆盖组织。将玻片置于湿盒中，4°C过夜或室温孵育1-2小时。

3. **洗涤**：用PBS或TBS缓冲液冲洗玻片，然后在摇床上洗涤3次，每次5分钟，彻底洗去未结合的一抗。

4. **孵育生物素标记的二抗**：滴加与一抗种属对应的生物素标记二抗（如一抗是兔来源，则用抗兔生物素二抗），室温孵育30-60分钟。

5. **洗涤**：同步骤3，用PBS/TBS洗涤3次，每次5分钟，彻底洗去未结合的二抗。

6. **孵育标记物-链霉亲和素**：滴加预先优化好浓度的酶（如HRP）或荧光素（如FITC、Cy3）标记的链霉亲和素，室温避光孵育30-60分钟。

7. **洗涤**：同步骤3，彻底洗涤，避免非特异性背景。

8. **信号检测**：

* **酶标法（HRP）**：滴加新鲜配制的底物显色液（如DAB），在显微镜下监控显色反应，适时用自来水终止反应。

* **荧光法**：无需显色，直接进行下一步。

9. **复染、封片与观察**：

* **酶标法**：通常进行苏木素复染细胞核，然后经过脱水、透明，用中性树胶封片。

* **荧光法**：滴加含DAPI的封片剂复染细胞核，直接盖上盖玻片，避免气泡，避光保存。

* 最后在相应的显微镜下观察并采集图像。

#### **三、核心注意事项与常见问题解析**

这是实验成败的关键，请务必仔细阅读。

1. **内源性生物素或过氧化物酶的阻断（重中之重）**

* **问题**：许多组织（如肝、肾、脑、脂肪）富含内源性生物素，内源性过氧化物酶（尤其在红细胞、粒细胞中）也会导致高背景或假阳性。

* **解决方案**：

* **生物素阻断**：在孵育一抗之前或之后（通常在二抗之前），使用**亲和素/生物素阻断试剂盒**。先加亲和素饱和内源性生物素，再加游离生物素饱和亲和素的剩余结合位点。

* **过氧化物酶阻断**：对于HRP系统，在孵育一抗前，用3%过氧化氢甲醇溶液或双氧水处理切片15-20分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。

2. **对照的设置**

* **阴性对照**：使用PBS或无关IgG代替一抗，所有其他步骤相同。用于确认信号的特异性。

* **阳性对照**：使用已知表达目标抗原的组织切片同步实验，确保整个实验系统工作正常。

* **空白对照**：省略生物素二抗或链霉亲和素步骤，用于排查试剂间的非特异性交叉反应。

3. **抗体稀释与孵育优化**

* 抗体浓度过高是背景过深的主要原因。务必进行抗体滴度测试，找到信噪比最佳的工作浓度。

* 孵育时间与温度需稳定。4°C过夜孵育通常比室温短时孵育特异性更高，背景更低。

4. **彻底洗涤**

* 所有步骤间的洗涤都必须充分、彻底。使用足量的缓冲液并在摇床上轻柔晃动，这是降低背景最简单有效的方法。

5. **防止干片**

* 整个孵育过程必须在湿盒中进行，确保组织切片始终处于湿润状态。一旦干片，会导致抗体非特异性吸附，产生无法消除的高背景。

6. **荧光实验的特殊注意事项**

* **避光**：从孵育荧光标记的链霉亲和素开始，所有步骤都需避光操作。

* **抗淬灭封片剂**：使用含抗淬灭剂的封片剂以延缓荧光信号衰减。

* **及时观察**：封片后尽快在荧光显微镜下观察，或于4°C避光保存，避免信号减弱。

#### **四、常见问题与解决方案**

* **背景过高**：

* 原因：封闭不充分、内源性物质未阻断、抗体浓度过高、洗涤不彻底、干片。

* 对策：检查并强化阻断步骤，优化抗体浓度，确保充分洗涤和湿盒操作。

* **无信号或信号弱**：

* 原因：一抗失效或浓度过低、抗原修复不当、试剂孵育顺序错误、链霉亲和素失活。

* 对策：验证抗体有效性，尝试不同的抗原修复方法，确认实验流程无误。

* **非特异性染色**：

* 原因：一抗或二抗的非特异性交叉反应。

* 对策：增加封闭血清浓度，在二抗中加入少量正常组织血清，或更换特异性更高的抗体。

**总结**：

生物素在玻片上使用步骤与注意事项

标签