食物中生物素叶酸的测定

全面解析：食物中生物素与叶酸的测定方法、重要性与应用

对于食品行业从业者、营养学家、质检人员或关注健康的爱好者来说，准确测定食物中的生物素（维生素B7）和叶酸（维生素B9）是一项至关重要的工作。这不仅关系到产品的营养标签合规、质量控制和研发创新，更是保障公众健康的基础。本文将系统性地介绍这两种维生素测定的核心知识，为您提供一份实用的指南。

一、 为什么要精确测定食物中的生物素和叶酸？

在深入了解“如何测定”之前，明确“为何测定”同样重要。其主要需求体现在以下几个方面：

1. 营养标签与法规合规： 世界各国食品法规（如中国的GB 28050、美国的FDA营养标签法规）都强制要求预包装食品标注其维生素含量。精确测定是满足这些法律要求的前提，避免虚假宣传和法律风险。
2. 食品质量控制与稳定性研究： 生物素和叶酸对光、热、pH值等加工条件敏感。通过测定可以监控从原料到成品整个生产链中维生素的保留率，优化加工工艺，确保产品质量稳定。
3. 营养强化食品的研发： 在开发婴幼儿配方奶粉、营养强化谷物、膳食补充剂等产品时，需要精确添加和测定维生素含量，以确保产品能达到宣称的营养功效。
4. 膳食调查与营养学研究： 准确的食物成分数据是进行膳食营养评估、研究维生素摄入与健康关系的基础。可靠的测定数据能帮助公共卫生机构制定更科学的膳食指南。
5. 真实性鉴别与欺诈检测： 对于某些高价食品（如某些天然健康产品），测定其实际维生素含量可用于鉴别其真伪和品质。

二、 测定的主要挑战是什么？

直接测定食物中的生物素和叶酸并非易事，主要挑战在于：

• 含量极低： 它们在食物中通常以微量（μg/100g或μg/kg）或痕量水平存在，需要高灵敏度的检测方法。
• 存在形式多样： 特别是叶酸，在自然界中存在多种形式（如5-甲基四氢叶酸、四氢叶酸、叶酰聚谷氨酸等），且生物利用率不同，增加了测定的复杂性。
• 基质干扰严重： 食物样品成分复杂，蛋白质、脂肪、碳水化合物等都会干扰目标物的提取和检测。
• 不稳定易降解： 两者均对光、氧、热敏感，在样品制备过程中容易分解损失，导致结果偏低。

因此，一个可靠的测定方法必须能够克服这些挑战。

三、 核心测定方法：样品前处理与仪器分析

现代分析化学已发展出成熟的方法来应对这些挑战，其流程通常分为样品前处理和仪器分析两大步骤。

1. 样品前处理（至关重要的一步）

前处理的目的是将目标维生素从复杂的食物基质中完全释放、净化并浓缩，同时尽量减少其降解。

• 对于叶酸测定：

  • 萃取： 通常使用缓冲溶液（如磷酸盐缓冲液+抗坏血酸，pH~7.0）并在121℃下进行高温萃取。抗坏血酸的作用是保护叶酸不被氧化。
  • 酶解： 这是关键步骤！天然食物中的叶酸大多以聚合谷氨酸的形式存在。必须使用** conjugase（结合酶，通常来源于鼠肝、鸡胰或微生物）** 将其水解为单谷氨酸形式，才能被准确检测和定量。
  • 净化与浓缩： 常使用固相萃取（SPE） 柱（如亲和色谱柱或C18柱）对萃取液进行纯化，去除杂质并浓缩目标物。

• 对于生物素测定：

  • 酸水解/酶水解： 生物素常与食物中的蛋白质结合。需要通过酸水解（如硫酸溶液） 或酶水解（如木瓜蛋白酶、淀粉酶） 来打破这种结合，释放出游离的生物素。
  • 净化： 同样可能需要SPE进行净化处理。

2. 仪器分析方法

目前，高效液相色谱（HPLC） 和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS） 是测定食物中生物素和叶酸的黄金标准。

• 高效液相色谱法（HPLC）配合检测器：

  • 紫外/二极管阵列检测器（UV/DAD）： 可用于叶酸和生物素的测定，但灵敏度相对较低，易受干扰，适用于含量较高或基质简单的样品。
  • 荧光检测器（FLD）： 叶酸本身具有荧光特性，因此HPLC-FLD是测定叶酸非常常用且灵敏的方法。通常需要氧化（如过氧化氢）将不同形式的叶酸转化为具有强荧光的蝶呤衍生物后进行检测。
  • 质谱检测器（MS）： 这是目前最权威、最灵敏、特异性最强的方法。

• 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）：

  • 原理： LC分离样品中的不同维生素形式，MS/MS通过母离子和子离子进行双重选择定性，极大程度地排除了基质干扰。
  • 优势：
    • 高灵敏度： 可检测极低含量的维生素。
    • 高特异性： 能准确区分和定量叶酸的多种形式（如5-MTHF、 folic acid等）以及生物素。
    • 多组分同时分析： 可以在一轮进样中同时测定生物素和多种形式的叶酸。
  • 尽管仪器昂贵、操作复杂，但LC-MS/MS因其卓越的准确性和可靠性，已成为实验室，尤其是第三方检测机构和大型食品企业的首选方法。

微生物法是一种经典的方法，利用乳酸菌（如Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469 for 叶酸；Lactobacillus plantarum ATCC 8014 for 生物素）的生长与维生素浓度成正比的原理进行定量。虽然成本较低，但操作耗时漫长（需培养16-24小时）、易受抗生素等抑制剂干扰、特异性差（测的是总活性而非具体形式），现已逐渐被色谱法取代，但仍作为参考方法在某些场景下使用。

四、 方法选择与标准参考

选择何种方法取决于您的具体目的、实验室条件和预算。

• 日常质量控制： 对于含量较高的强化食品，HPLC-UV/FLD可能是经济实惠的选择。
• 科研与精准定量： 对于需要区分维生素形式、检测天然食物中微量成分或要求最高准确度的场合，LC-MS/MS是无可争议的最佳选择。
• 标准遵循： 进行检测时，应优先遵循国家或国际标准方法，例如：
  • 中国国标（GB）： GB 5009.259（食品中生物素的测定）、GB 5009.211（食品中叶酸的测定）均主要推荐了微生物法和色谱法。
  • AOAC国际标准： AOAC Official Method 2011.13（LC-MS/MS测配方食品中的叶酸）等。

总结

食物中生物素和叶酸的测定是一项技术要求高但极其重要的工作。成功的测定依赖于：

1. 精心设计的样品前处理，特别是有效的酶解步骤，以确保维生素的完全释放和转化。
2. 选择先进、合适的仪器平台，LC-MS/MS因其高灵敏度、高特异性和多组分同时分析能力，已成为解决这一分析难题的最有力工具。
3. 严格的质量控制，包括使用标准品、加标回收实验等，以确保数据的准确可靠。