测序引物带生物素标记么

测序引物带生物素标记吗？一文读懂其应用与选择策略

直接答案：有时会，但不总是。 测序引物是否带有生物素标记，完全取决于具体的测序技术、实验目的和建库流程。生物素标记是一种强大的工具，但并非所有测序场景都需要它。

为了更好地理解，我们将从“为什么需要标记”、“哪些场景需要”以及“如何选择”三个维度来全面解析这个问题。

一、 为什么要在测序引物上标记生物素？

生物素（Biotin）是一种小分子维生素，它与链霉亲和素（Streptavidin）之间具有超高亲和力（结合常数Ka ~ 10^15 M⁻¹），这种结合几乎是不可逆的、高度特异且稳定的。

在测序中，利用这个特性，我们可以实现一个核心功能：分离与富集。

1. 抓取目标分子：带有生物素标记的引物在PCR扩增后，会将生物素分子引入到新合成的DNA链末端。随后，通过包被有链霉亲和素的磁珠，就可以像“磁铁吸铁屑”一样，将目标DNA片段从复杂的混合物中高效地分离和纯化出来。
2. 实现单链分离：在下一代测序（NGS）建库中，经常需要获取单链DNA文库。生物素标记引物扩增后，经碱变性产生双链，再用链霉亲和素磁珠抓取，由于一条链带有生物素而被牢固结合在磁珠上，另一条链则可以被洗脱下来，从而轻松获得纯化的单链DNA。
3. 定向固定：在一些特殊的测序平台或杂交检测中，可以将DNA分子通过生物素-链霉亲和素系统定向地固定在固相表面（如芯片、流道），便于后续的测序反应进行。

二、 哪些常见的测序场景需要生物素标记引物？

这才是用户真正关心的问题。以下是几个最典型的应用场景：

1. NGS文库制备（尤其是链特异性文库）
在构建链特异性RNA-seq文库时，通常会在第二条cDNA链合成时使用生物素标记的dUTP或引物。随后用链霉亲和素磁珠富集带有生物素的第二条链，并对其进行酶切消化，最终保留下来的都是第一条链的信息，从而准确记录转录本原始的方向信息。

2. 靶向测序与目标区域富集（如液相杂交捕获）
这是生物素标记引物最广泛的应用领域之一。

• 过程：首先使用带有生物素标记的引物对待测DNA目标区域进行多重PCR扩增。扩增完成后，产物混合液中所有片段的一端都带有了生物素。
• 富集：将混合液与链霉亲和素磁珠共同孵育，所有PCR产物都会被吸附到磁珠上。通过简单的清洗步骤去除未结合的引物、dNTPs、酶等杂质，最后洗脱下来的就是纯净的、准备好用于测序的目标DNA文库。
• 优势：这种方法实现了对特定基因Panel、外显子组或自定义区域的高效富集和纯化，极大提高了测序效率和数据质量。

3. 甲基化测序（如RRBS）
在简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）中，通常会使用生物素标记的引物进行PCR。因为亚硫酸氢盐处理后的DNA序列复杂度低，非特异性产物多。通过生物素磁珠纯化，可以高效地筛选出大小合适的、真正来自酶切片段的PCR产物，去除引物二聚体等干扰。

4. 一些特殊的第一代测序应用
在传统的Sanger测序中，虽然不常见，但若需要对测序产物进行纯化或固定时，也可能使用生物素标记的引物。

三、 哪些情况不需要生物素标记？

常规的PCR测序、克隆测序或无需特殊纯化/富集步骤的NGS建库（如很多基于转座酶的“tagmentation”建库法），其测序引物通常是不带有任何标记的普通寡核苷酸引物。添加标记只会增加不必要的成本。

四、 如何判断与选择？给实验者的建议

1. 遵循官方协议：你所使用的商业化的建库试剂盒或捕获试剂盒会明确指定是否需要以及何时使用生物素标记的引物。请务必严格遵循说明书进行操作。
2. 明确实验目的：
   • 如果你的实验是全基因组测序（WGS） 或常规转录组测序（普通RNA-seq），大概率不需要自己考虑生物素引物，试剂盒已提供优化方案。
   • 如果你的实验是外显子组测序（WES）、靶向基因Panel测序、RRBS或链特异性RNA-seq，那么你几乎肯定会用到生物素标记的引物或核苷酸。
3. 注意标记位置：生物素通常标记在引物的5’末端，这样可以确保在PCR延伸后，生物素被完整地引入到新合成双链DNA的末端，而不会干扰引物的退火和延伸功能。

五、 潜在问题与注意事项

• 非特异性结合：链霉亲和素磁珠对生物素的特异性极高，但磁珠本身可能对某些类型的DNA（如非常短的单链DNA）有非特异性吸附，需通过优化缓冲液条件来避免。
• 成本：生物素标记的引物比普通引物昂贵许多。
• 储存与稳定性：生物素标记引物应避光保存，并避免反复冻融，以保持其稳定性。