测序的生物素是什么成分的

测序中的“生物素”：成分、作用与应用全解析

在阅读下一代测序（NGS）相关文献或实验方案时，“生物素”这个词会频繁出现。无论是“生物素标记的探针”、“链霉亲和素磁珠”还是“液相捕获”，它都是许多高端测序技术的核心基石。那么，这个关键的“生物素”究竟是什么成分？它在测序中又扮演着怎样的角色？本文将为您一一揭晓。

一、 生物素的本质：它到底是什么成分？

简单来说，生物素（Biotin），也被称为维生素B7或维生素H，是一种水溶性B族维生素。

从化学成分上看，它是一个由脲基环和噻吩环融合而成的杂环羧酸。这个结构看似复杂，但我们可以抓住其两个关键部分来理解它的功能：

1. 羧基（-COOH）：这个基团是生物素的“抓手”，可以通过化学反应（如酰胺化反应）与其他分子（如DNA、RNA或蛋白质）共价结合，从而实现对目标分子的“标记”或“标签”。这就是我们常说的“生物素化”（Biotinylation）。
2. 脲基环：这是生物素最神奇的部分，它是链霉亲和素（Streptavidin） 或 亲和素（Avidin） 的高亲和力结合位点。

最关键的特性在于：生物素与链霉亲和素之间的结合作用是目前已知的最强非共价相互作用之一，结合常数（Kd）高达10^-15 mol/L，这种结合具有极高的特异性、稳定性和抗干扰能力（几乎不受酸碱度、温度、有机溶剂和变性剂的影响）。

总结：测序中所用的生物素，其本质是一种维生素分子。它通过其羧基“抓住”需要标记的核酸序列，再通过其脲基环“钩住”链霉亲和素，从而搭建起分离和富集目标的桥梁。

二、 为什么测序技术格外“青睐”生物素？

NGS技术的核心目标之一是从复杂的遗传背景中高效、准确地捕获我们感兴趣的基因片段。生物素-链霉亲和素系统完美地满足了这一需求：

• 极高的亲和力：一旦结合，几乎不会意外解离，保证了捕获的高效性和准确性，极大降低了假阳性或假阴性率。
• 极高的特异性：链霉亲和素几乎只专一性地结合生物素，避免了与其他生物分子的非特异性结合，信噪比极高。
• 模块化与灵活性：生物素可以很方便地标记到 oligonucleotide 探针、引物或核苷酸上，使得实验设计非常灵活。

三、 生物素在测序中的核心应用场景

生物素在测序中的应用主要体现在“富集”和“捕获”环节，主要有以下两种主流方式：

1. 液相杂交捕获（Liquid-phase Hybridization Capture）
这是目前最主流的靶向测序方案（如外显子组测序、基因Panel测序）所采用的技术。

• 过程：
  1. 探针标记：预先设计好的一系列针对目标基因组区域（如所有外显子）的RNA或DNA探针，其末端都标记有生物素。
  2. 杂交：将打断后的基因组DNA文库（通常大于200bp）与这些生物素化的探针混合，进行液相杂交。探针会找到并互补结合到其目标DNA片段上。
  3. 捕获与富集：向体系中加入包被有链霉亲和素的磁珠。生物素标记的探针（以及与之结合的目标DNA片段）会被磁珠牢牢捕获。
  4. 清洗与洗脱：利用磁性分离架吸住磁珠，并通过清洗步骤去除所有未结合的非目标DNA片段。最后通过变性条件将纯净的目标DNA片段从探针上洗脱下来，用于后续的测序上机。
• 代表技术：Illumina的TruSeq、IDT的xGen、Agilent的SureSelect等。

2. 基于磁珠的文库纯化与筛选
这在建库过程中非常常见，例如：

• cDNA纯化：在RNA测序建库中，常使用生物素标记的 oligo(dT) 引物来捕获带有PolyA尾的mRNA，随后用链霉亲和素磁珠进行纯化。
• PCR产物纯化：双链DNA文库末端修复后加A尾，并连接测序接头。此时接头本身可能就带有生物素标记，方便后续的纯化步骤，以去除未连接的接头和引物二聚体。
• 目标片段分选：例如在单细胞测序（如10x Genomics）中，带有细胞Barcode和UMI的凝胶磁珠（Gel Bead）表面就含有链霉亲和素，用于捕获生物素标记的 oligonucleotide。

四、 常见误区与注意事项

• 误区：生物素本身可以被“测序”出来。
  正解：生物素只是一个“标签”或“手柄”，它本身不是遗传信息。测序仪读取的是A, T, C, G的碱基序列。生物素的作用是在测序前帮助我们把这些带有特定序列的片段“找出来”和“洗干净”。
• 注意事项：
  • 避光保存：生物素试剂对光敏感，应按照说明书避光保存和使用。
  • 避免还原剂：强还原剂（如DTT）会破坏生物素的活性，在涉及链霉亲和素结合的缓冲液中应避免使用高浓度的还原剂。
  • 实验优化：生物素化探针的浓度、杂交时间、洗脱强度等都需要根据具体实验进行优化，以在捕获效率和特异性之间取得最佳平衡。

五、 如何选择生物素化的产品？

对于研究者而言，通常不需要直接购买生物素原料，而是选择成熟的商业化产品：

• 生物素标记的探针/引物：可从多家生物公司（如IDT, Thermo Fisher, 锐博生物等）定制合成，需指明标记位置（5‘端、3’端或内部）和标记密度。
• 链霉亲和素磁珠：有多种规格（如Dynabeads™, Sera-Mag™等），需根据实验规模和处理通量选择合适的产品。

总结

生物素，作为一种天然的小分子维生素，凭借其与链霉亲和素之间无可匹敌的结合强度和特异性，成为了现代高通量测序技术中不可或缺的“分子钩”。它是实现精准靶向捕获、高效文库纯化和复杂样本处理的关键工具。理解它的成分和工作原理，将有助于我们更好地设计实验、解读结果并 troubleshooting，从而更有效地从海量的基因数据中挖掘出宝贵的生物学信息。