测序的生物素是什么成分

揭秘测序中的“魔法抓手”：生物素——成分、原理与应用全解析

在阅读高通量测序（NGS）相关文献或实验方案时，“生物素”这个词会频繁出现。它总是与“富集”、“抓取”、“探针”等词汇联系在一起，扮演着一个至关重要的“魔法抓手”角色。那么，这个在测序中不可或缺的生物素，究竟是什么成分？它又是如何工作的？本文将为您一一揭晓。

一、 核心解答：测序中的生物素是什么成分？

简单来说，测序中使用的生物素（Biotin）本身就是一种水溶性B族维生素，也被称为维生素B7或维生素H。

但从化学角度来看，我们通常指的是生物素化的衍生物。关键在于“化”这个字，这意味着生物素分子被通过一个化学链接臂（Linker）共价连接到了另一个分子上，从而创造出一个“标记工具”。

它的核心化学成分结构包括：

1. 一个脲咪唑酮环：这是与链霉亲和素（Streptavidin）超高亲和力结合的关键部位。
2. 一个戊酸侧链：这个侧链上的羧基（-COOH）是进行化学修饰的“把手”。科学家通过这个把手，将生物素连接到其他分子上，如核苷酸、DNA/RNA oligos、抗体等。

因此，当您在测序 protocols 中看到“biotinylated dNTPs”或“biotinylated probes”时，指的就是：

• 本体：一个标准的核苷酸（如dUTP）或一段DNA探针。
• 标签：通过链接臂连接在其上的生物素分子。
  这个组合体就成为了一个“诱饵”，可以利用生物素-链霉亲和素系统进行后续操作。

二、 为什么偏偏是生物素？——其不可替代的优势

测序技术可以选择多种标签分子，但生物素-链霉亲和素系统因其无与伦比的优势成为了金标准：

1. 超高亲和力（Ultra-high Affinity）：生物素与链霉亲和素（或其亲戚亲和素Avidin）的结合常数（Kd）高达10^-15 M，是自然界中最强的非共价相互作用之一。这种结合几乎不可逆，确保了“抓取”过程的高效和稳定，远超抗原-抗体反应。
2. 极高特异性（High Specificity）：两者的结合特异性极强，几乎不受其他生物分子的干扰，能有效避免非特异性结合，保证实验结果的“信噪比”。
3. 一对一结合（1:1 Binding Stoichiometry）：一个生物素分子精确地结合一个链霉亲和素分子。这种明确的化学计量关系使得反应可控且可量化。
4. 灵活性（Flexibility）：链霉亲和素可以很容易地被标记上荧光基团（如FITC）、酶（如辣根过氧化物酶HRP）、磁珠等。这意味着一旦生物素抓住了目标，我们就可以通过链霉亲和素上的这些标签进行检测、显色或分离。

三、 生物素在测序中的核心应用场景

生物素在测序的多个关键环节中发挥着重要作用，主要分为两大类：文库制备中的富集和目标区域捕获。

1. 文库制备富集（Library Preparation Enrichment）

• illumina桥式PCR扩增后的“抓取”：在Illumina边合成边测序（SBS）技术的经典流程中，桥式PCR在流动槽（Flow Cell）上生成DNA簇（clusters）。这些DNA簇的一端是通过生物素标记的引物固定到通道上的。在测序开始时，加入的测序引物之所以能特异性地启动测序反应，就是因为这些DNA簇已经被生物素“锚定”在了正确的位置。
• 链特异性文库构建：在构建链特异性RNA-seq文库时，会使用生物素标记的dNTPs（如biotin-11-dUTP）在第二链cDNA合成时掺入。随后，利用链霉亲和素磁珠选择性地纯化第二链cDNA，从而确保最终测序的文库能保留 strand 信息。

2. 目标区域捕获（Target Enrichment）

这是生物素应用最广的场景，主要用于外显子测序、基因Panel测序等。

• 原理：首先设计一系列与目标基因组区域（如所有外显子）互补的DNA探针，这些探针的末端都标记有生物素。
• 过程：
  • 将打断后的基因组DNA文库（已加接头）与生物素化的探针混合杂交。
  • 加入包被有链霉亲和素的磁珠。
  • 生物素探针会通过杂交捕获到目标DNA片段，而链霉亲和素磁珠则通过生物素“抓住”这些探针-目标片段复合物。
  • 通过磁场吸附磁珠，洗去所有未杂交的非目标DNA片段。
  • 最后将富集到的目标DNA片段从磁珠上洗脱下来，进行后续的PCR扩增和测序。
• 优势：这种方法可以高效地从全基因组中“钓”出我们感兴趣的1%-2%的序列，极大降低了测序成本和数据分析复杂度。

四、 实验中的注意事项

虽然生物素系统非常强大，但在使用时也需注意：

• 避免光照：生物素对光敏感，尤其是标记了荧光基团的复合物，应避光保存和操作。
• 注意pH值：强酸性条件（pH < 2.0）可能会破坏生物素-链霉亲和素的结合，常用于洗脱步骤。而中性pH值则用于结合和洗涤。
• 避免还原剂：β-巯基乙醇（BME）或二硫苏糖醇（DTT）等还原剂会破坏链霉亲和素的四级结构，导致其失活。

总结