测序的生物素是什么

揭秘测序中的“魔法钩子”：生物素

在阅读二代测序（NGS）相关文献或实验流程时，“生物素”这个词会频繁出现。它看似一个微小的细节，实则是整个技术流程中不可或缺的“魔法钩子”。本文将全面解析测序中的生物素是什么、为什么是它、以及它如何发挥作用，帮助您彻底理解这一关键工具。

一、生物素是什么？从维生素到分子工具

首先，我们需要厘清一个概念：测序中使用的生物素（Biotin）和作为维生素B7的生物素在化学结构上是同一个分子。它是一种水溶性维生素，又称维生素H或辅酶R。

然而，在测序技术中，我们利用的并非它的维生素功能，而是它的一种独特生物学特性：生物素能够以极高的亲和力和特异性与链霉亲和素（Streptavidin）或亲和素（Avidin）结合。这种结合被认为是自然界中最强的非共价相互作用之一，结合常数极高，一旦结合就几乎不可逆。

因此，在测序领域，当我们提到“生物素”时，通常指的是经过化学修饰的、带有生物素标记的分子（如生物素化的核苷酸、引物或探针）。这些分子成为了我们精准抓取目标序列的“钩子”。

二、为什么测序技术如此偏爱生物素？

NGS技术核心之一是如何将待测的DNA模板固定到特定的表面（如流动槽的通道上）并进行扩增与检测。生物素-链霉亲和素系统提供了完美的解决方案：

1. 极高的亲和力：结合牢固，在后续的洗涤和检测步骤中不会轻易脱落，保证了信号的稳定性和实验的可靠性。
2. 极高的特异性：链霉亲和素几乎只与生物素结合，背景噪音低，非特异性结合少，信噪比高。
3. 灵活性：生物素可以很方便地连接到各种分子上，如DNA、RNA、蛋白质等，应用场景广泛。

三、生物素在关键测序技术中的应用场景

生物素在多个主流测序平台和技术中扮演着核心角色，最典型的是Illumina测序法。

1. Illumina边合成边测序（SBS）技术

这是生物素最经典的应用。在Illumina的测序流程中，生物素主要用于双末端测序（Paired-End Sequencing）。

• 流程简述：
  1. 桥式PCR：DNA片段两端连上不同的接头，在流动槽表面通过桥式PCR扩增成簇。
  2. 第一轮测序：进行读段1（Read 1）的序列测定。
  3. “钩子”出场：读段1完成后，需要测定片段另一端的序列（读段2）。此时，文库构建时使用的一端带有生物素标记的接头就发挥了作用。
  4. 链霉亲和素捕获：向流动槽中加入包裹着链霉亲和素的磁珠。这些磁珠会特异性地抓住带有生物素标记的DNA链。
  5. 洗脱与再生成簇：通过变性洗脱，将这些被抓住的DNA链释放出来，并在流动槽的另一个区域进行第二次桥式PCR，生成新的簇。
  6. 第二轮测序：最后对这些新簇进行读段2（Read 2）的测序。

通过这个“生物素-链霉亲和素-磁珠”系统，Illumina巧妙地实现了对同一条DNA片段两端的分别测序，从而获得更准确的序列信息和结构变异信息。

2. 靶向测序与富集

生物素也是目标区域富集技术的核心，例如：

• 液相杂交捕获：设计与目标基因组区域互补的探针，并在这些探针的末端标记上生物素。将探针与打断的基因组DNA文库混合杂交，然后加入链霉亲和素包被的磁珠。只有与探针结合的目标DNA片段（带有生物素）会被磁珠捕获，而非目标DNA则被洗去。最终洗脱下来的就是高度富集的目标区域DNA，可用于下游测序。这种技术广泛应用于外显子组测序、癌症基因panel测序等。

3. 单细胞测序

在10x Genomics等单细胞测序平台中，用于捕获单个细胞的凝胶珠（Gel Bead）表面就偶联有链霉亲和素，用来抓取带有生物素标记的测序接头，从而实现将单个细胞的mRNA与特定Barcode信息的结合。

四、常见问题解答（FAQ）

Q1: 生物素标记的核苷酸（如Bio-dUTP）是直接用来测序的吗？
A: 在传统的Illumina SBS测序中，使用的是一般带有可切割荧光基团的dNTP。Bio-dUTP等更常用于** pull-down assay**、FISH或一些特殊的老一代测序方法中，用于标记和捕获新合成的DNA。但在NGS的文库制备环节，生物素标记的是接头（Adapter） 而非核苷酸本身。

Q2: 实验中如何选择生物素和链霉亲和素产品？
A: 链霉亲和素（Streptavidin）比亲和素（Avidin）更常用，因为后者带有正电荷且是糖基化蛋白，容易产生非特异性结合。链霉亲和素中性且结合特异性更高。选择时需注意产品的纯度、偶联的磁珠大小（影响结合效率）和缓冲体系。

Q3: 生物素-链霉亲和素结合会被打断吗？
A: 常规条件下极难打断。但在极高温度（>70°C）下，或在含有强变性剂（如SDS）的缓冲液中煮沸，可以使其解离。这正是在杂交捕获后，将目标DNA从链霉亲和素磁珠上洗脱下来的常用方法。

总结