生物素，又称维生素B7或维生素H，是生物体内多种羧化酶辅酶的重要组成部分，对人体代谢、皮肤健康、毛发生长都至关重要。因此，准确测定样品中生物素的含量，在食品营养强化、药品质量控制、临床诊断和饲料工业等领域具有广泛的应用价值。本文将深入浅出地解析测定生物素的核心原理、主流方法及其优缺点，助您全面理解这一技术。
在探讨原理之前，需了解其测定难点：
因此，测定方法需要兼具高灵敏度、高特异性和强大的抗干扰能力。
目前，测定生物素的主流方法主要分为两大类：微生物学法和理化分析法。
这是历史最悠久、被国际公认的参考方法（如AOAC官方方法）。
基本原理： 利用特定微生物（通常为乳酸杆菌属的Lactobacillus plantarum ATCC 8014）的生长绝对依赖于环境中生物素的特性。将待测样品经过一系列酶解（如木瓜蛋白酶、淀粉酶等）和提取处理，释放出生物素并制成测试液。将测试液加入不含生物素的培养基中，接种菌株后进行培养。 微生物的生长程度与生物素的含量在一定浓度范围内呈正比例关系。通过测量培养液的浊度（吸光度值），与已知浓度的生物素标准曲线进行比较，即可计算出样品中生物素的含量。
流程概要： 样品预处理（酶解、提取、过滤） → 制备培养基和测试液 → 接种微生物 → 培养（24-48小时） → 测定吸光度 → 绘制标准曲线并计算结果。
优点：灵敏度极高、成本较低、能够测定具有生物可利用性的总生物素含量。
缺点：操作繁琐耗时长、易受抗生素或其他抑制剂干扰、需要专门的微生物实验室。
HPLC是当前应用最广泛的理化分析方法之一。
基本原理： 利用不同物质在固定相和流动相之间分配系数的差异进行分离。样品经过提取和纯化后注入色谱柱，由于生物素与其他成分在色谱柱中的保留时间不同，从而被分离开来。流出的生物素通过检测器进行定量分析。 由于生物素本身缺乏强紫外吸收或荧光发射特性，通常需进行柱前或柱后衍生化处理，使其与衍生化试剂（如荧光素标记物）反应，生成具有强荧光或强紫外吸收的衍生物，再由荧光检测器（FLD） 或紫外检测器（UV） 进行高灵敏度检测。
流程概要： 样品提取（酸解/酶解） → 纯化（固相萃取SPE） → 衍生化 → HPLC进样分离 → 检测器检测 → 根据保留时间和峰面积定量。
优点：特异性强、自动化程度高、分析时间相对较短、能同时分离多种维生素。
缺点：前处理复杂、设备昂贵、需要衍生化步骤增加了操作难度。
ELISA法基于抗原抗体特异性结合的原理，开发出了商业化的试剂盒。
基本原理： 将针对生物素的特异性抗体包被在微孔板上。加入待测样品和酶标记的生物素（竞争物），样品中的游离生物素与酶标记生物素竞争结合有限的抗体位点。冲洗后，加入酶底物显色。 颜色深度与样品中生物素的含量成反比。样品中生物素越多，与抗体结合的酶标记生物素就越少，最终显色就越浅。通过测量吸光度，对照标准曲线即可算出含量。
流程概要： 样品简单提取 → 加样至抗体包被板 → 加入酶标记物 → 孵育竞争结合 → 洗涤 → 加底物显色 → 终止反应 → 测吸光度 → 计算结果。
优点：操作简便、速度快、通量高、灵敏度好、无需大型仪器。
缺点：可能存在交叉反应、试剂盒成本较高、准确性易受基质效应影响。
如何选择？
注册账号 | 忘记密码
