测定生物素的纯度实验报告

生物素纯度测定实验报告（HPLC法）

摘要： 本实验采用高效液相色谱法（HPLC）对生物素样品进行纯度测定。通过建立外标法校准曲线，对样品进行分析，并计算其纯度。实验结果表明，该方法精密度高，重复性好，能够准确、有效地测定生物素的纯度，为生物素的质量控制提供了可靠依据。

关键词： 生物素；纯度测定；高效液相色谱法；HPLC；实验报告

一、 引言

生物素（Biotin），又称维生素H或维生素B7，是一种重要的水溶性维生素，在人体新陈代谢、尤其是糖类、脂肪和蛋白质的合成与分解中起着至关重要的作用。其纯度直接影响其在医药、保健品、化妆品及饲料添加剂等领域的产品质量和功效。因此，建立一种准确、快速、灵敏的生物素纯度测定方法至关重要。

高效液相色谱法（HPLC）因其高分离效能、高灵敏度和良好的重现性，已成为测定维生素纯度的首选方法。本实验报告详细阐述了采用HPLC外标法测定生物素纯度的完整流程、结果计算及注意事项，旨在为相关从业人员提供一份标准、规范的实验参考。

二、 实验原理

本方法基于高效液相色谱的分离检测技术。将生物素样品溶解于合适的流动相中，经高压输液泵送入色谱柱（通常为C18反相色谱柱）。由于样品中各组分（包括生物素主成分与杂质）在固定相和流动相之间的分配系数不同，它们在色谱柱中的迁移速度也不同，从而得以分离。

分离后的生物素组分随流动相流出色谱柱，进入紫外检测器（UVD）或二极管阵列检测器（DAD）。生物素在特定波长（通常为210 nm左右）下有最大吸收，检测器将光信号转化为电信号，由数据处理系统记录并形成色谱图。通过比较样品溶液与标准品溶液的色谱峰面积，采用外标法即可计算出样品中生物素的含量（纯度）。

三、 实验仪器与试剂

1. 主要仪器：

• 高效液相色谱仪（配有紫外检测器或DAD检测器、自动进样器）
• C18反相色谱柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm 或类似规格）
• 分析天平（精度0.0001 g）
• 超声波清洗器
• 微量滤膜（0.45 μm或0.22 μm，水系）
• 容量瓶、移液管等玻璃器皿

2. 主要试剂：

• 生物素对照品（已知高纯度，≥99.0%）
• 生物素样品（待测样品）
• 色谱纯甲醇
• 色谱纯乙腈
• 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）或磷酸（H₃PO₄），分析纯
• 超纯水（18.2 MΩ·cm）

四、 实验步骤

1. 流动相制备：
称取适量磷酸二氢钾，用超纯水溶解并定容，配制成0.02 mol/L的磷酸二氢钾溶液（pH≈4.5）。将此溶液与色谱纯乙腈按 75：25 (v/v) 的比例混合，用0.45 μm滤膜过滤并超声脱气15分钟备用。

2. 对照品溶液制备：
精密称取生物素对照品约25 mg（精确至0.0001 g），置于50 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取此储备液5 mL，置于50 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤后，即得浓度为约50 μg/mL的对照品工作液。

3. 供试品溶液制备：
精密称取生物素样品约25 mg（精确至0.0001 g），按“对照品溶液制备”同法处理，制成浓度相当的供试品溶液。

4. 色谱条件：

• 色谱柱： C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)
• 流动相： 0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液 (pH=4.5) - 乙腈 (75：25)
• 检测波长： 210 nm
• 流速： 1.0 mL/min
• 柱温： 30 °C
• 进样量： 10 μL

5. 系统适用性试验：
在上述色谱条件下，连续注入对照品溶液5针，记录色谱图。要求生物素色谱峰的理论塔板数（n）应不低于5000，拖尾因子（T）应在0.95~1.05之间，连续进样的峰面积相对标准偏差（RSD）应不大于2.0%，表明系统精密度良好。

6. 测定：
待基线稳定且系统适用性要求合格后，依次精密注入对照品溶液和供试品溶液各10 μL，记录色谱图，测量生物素主峰的峰面积。

五、 实验结果与计算

1. 数据记录：

（注：以上数据为示例，实际数据需根据实验测定结果填写）

2. 纯度计算（外标法公式）：

生物素纯度 (%) = (Au × Cs × V × D × 100%) / (As × m × 1000)

式中：

• Au： 供试品溶液峰面积的平均值
• As： 对照品溶液峰面积的平均值
• Cs： 对照品溶液的浓度 (mg/mL)
• V： 供试品溶液的初始定容体积 (mL)
• D： 供试品溶液的稀释倍数（本例中为1，若无二次稀释则不计算）
• m： 供试品的称样量 (mg)
• 1000： 单位换算系数（μg到mg）

代入示例数据计算：

• Cs = 25.12 mg / 50 mL = 0.5024 mg/mL
• Au = 1248005
• As = 1255502
• m = 24.98 mg
• V = 50 mL
• D = 1

纯度 (%) = (1248005 × 0.5024 × 50 × 1 × 100%) / (1255502 × 24.98 × 1000) = 98.5%

结论： 本次测定的生物素样品纯度为 98.5%。

六、 注意事项与常见问题分析

1. 样品溶解性： 生物素在水中溶解度较差，需确保其完全溶解于流动相中，必要时可辅以超声助溶，但需避免长时间超声导致降解。
2. pH值控制： 流动相的pH值对生物素的峰形和保留时间影响显著，必须精确配制，建议使用pH计校准。
3. 滤膜选择： 过滤样品时，需根据流动相性质选择有机系或水系滤膜，避免滤膜材质溶解或吸附样品，造成误差。
4. 柱效下降： 若出现理论塔板数过低或峰拖尾严重，可能是色谱柱污染或柱效下降，需对色谱柱进行清洗和再生。
5. 基线噪音： 基线不稳或噪音大，可能是流动相未充分脱气或系统中有气泡，应重新脱气并冲洗流路。
6. 结果偏差： 若结果偏差较大，应检查天平称量、容量瓶定容、移液操作是否精确，这是 HPLC 分析中误差的主要来源之一。

七、 结论

本实验成功建立了利用HPLC外标法测定生物素纯度的方法。该方法操作简便，结果准确，重现性好，系统适用性试验符合要求，可用于生物素原料及其制剂的质量控制和纯度分析。本次被测生物素样品的纯度为98.5%，符合常见产品规格要求。