细胞裂解液含有生物素

细胞裂解液中含生物素：影响、检测与解决方案

细胞裂解液中含有生物素是分子生物学实验中常见的情况，这可能来自细胞自身的生物素化蛋白或实验中添加的生物素标记物。无论是哪种情况，都会对基于生物素-链霉亲和素系统的实验带来显著干扰。本文将全面分析这一问题及其解决方案。

生物素的来源及其对实验的影响

生物素的内源性来源：

• 生物素是一种水溶性维生素（维生素B7），天然存在于所有活细胞中
• 细胞内多种羧化酶是天然生物素化蛋白，如丙酮酸羧化酶、乙酰-CoA羧化酶等
• 平均每个哺乳动物细胞含有约10^6个生物素分子

外源性生物素来源：

• 实验设计中故意添加的生物素标记物
• 细胞培养基中添加的生物素补充剂
• 实验操作中可能引入的污染

对实验系统的干扰：
生物素-链霉亲和素系统因其极高的亲和力（Kd≈10^-15 M）而被广泛应用于Western blot、免疫沉淀、免疫组化等实验。但当细胞裂解液中存在游离生物素或生物素化蛋白时，会竞争性结合链霉亲和素，导致：

1. Western blot检测中背景信号增高或特异性信号降低
2. pull-down实验效率下降
3. ELISA检测结果失真
4. 免疫组化染色异常

检测细胞裂解液中生物素的方法

如果您怀疑细胞裂解液中存在生物素干扰，可通过以下方法确认：

点印迹法（Dot Blot）：

1. 将细胞裂解液系列稀释后点在硝酸纤维素膜上
2. 用链霉亲和素-HRP孵育
3. 化学发光检测，与阴性对照比较信号强度

竞争性ELISA检测：
使用商品化的生物素检测试剂盒，可定量测定裂解液中生物素浓度

阴性对照实验：
在Western blot实验中设置不加一抗的对照，若仍出现信号，表明存在内源性生物素或链霉亲和素非特异性结合

消除生物素干扰的实用策略

实验前预防措施

选择替代系统：
考虑使用不与生物素竞争的其他高亲和力系统，如：

• 抗地高辛抗体-地高辛系统
• 荧光蛋白标签系统
• 其他表位标签系统（HA、FLAG、Myc等）

使用单体亲和素：
单体亲和素（如NeutrAvidin、CaptAvidin）对生物素的亲和力较低，可减少非特异性结合，同时在酸性条件下可释放结合的生物素，便于膜再生。

培养基优化：
在实验前使用无生物素的培养基培养细胞，降低细胞内生物素水平。

实验过程中解决方案

预处理裂解液：

1. 使用游离亲和素饱和生物素：在裂解液中添加过量游离链霉亲和素，孵育后通过离心去除复合物
2. 使用生物素结合树脂：如Monomeric Avidin树脂，可特异性去除游离生物素和弱结合的生物素化蛋白

改进实验流程：

1. 增加封闭步骤：使用含游离生物素或亲和素的封闭液
2. 调整抗体浓度：优化一抗和链霉亲和素偶联二抗的浓度，降低非特异性结合
3. 增加洗涤强度：提高洗涤液中的盐浓度或添加温和去垢剂

热变性处理：
95-100°C加热样品5-10分钟可使许多内源性生物素化蛋白变性并沉淀，通过离心去除，但可能不适用于所有实验。

特异性识别真正目标信号

设置严谨对照：

1. 阴性对照：不加一抗的样品
2. 竞争对照：加过量游离生物素竞争结合的样品
3. 敲低/敲除对照：使用生物素化蛋白基因敲除的细胞

使用不同检测方法验证：
用非生物素依赖的方法验证结果，如直接偶联HRP的二抗或荧光标记二抗。

特殊情况：利用内源性生物素

在某些情况下，内源性生物素可被利用作为内参：

内源性生物素化蛋白作为内参：
某些分子量明确的生物素化蛋白（如哺乳动物细胞中的120 kDa和75 kDa蛋白）可作为Western blot的内参，但需先验证其在特定细胞系中的表达稳定性。

注意事项：
使用内源性生物素化蛋白作为内参时，需确保实验处理不会影响这些蛋白的表达水平，且其信号强度在线性检测范围内。

结论

细胞裂解液中存在生物素确实会给基于生物素-亲和素系统的实验带来挑战，但通过了解其来源、实施适当的检测方法并采取有效的预防和解决措施，完全可以克服这些困难。关键是根据具体实验需求选择合适的策略，并始终设置严谨的对照以确保结果的可靠性。