细胞内源生物素

细胞内源生物素：概述、干扰问题与有效阻断方案

细胞内源生物素是指在细胞内部天然存在的生物素分子，它是一种水溶性B族维生素（维生素B7），作为多种羧化酶的辅酶参与细胞的代谢过程。然而，在科学研究，尤其是基于生物素-链霉亲和素系统的高灵敏度检测实验（如Western Blot、免疫组化IHC、免疫荧光IF和流式细胞术）中，内源生物素会与非标记的链霉亲和素或亲和素结合，导致高背景、假阳性结果和数据偏差，成为一个常见的干扰源。

一、 内源生物素的存在与分布

内源生物素并非均匀分布在所有组织和细胞中。了解其分布特点是识别和解决干扰问题的第一步。

• 高表达组织/细胞类型：

  • 肝脏、肾脏：富含参与能量代谢的羧化酶。
  • 乳腺、乳腺肿瘤细胞：生物素表达水平通常较高。
  • 肾上腺、脂肪组织、大脑。
  • 线粒体丰富的细胞：因为生物素是线粒体代谢酶的关键辅因子。

• 实验方法的影响：

  • 使用石蜡包埋的组织样本时，常规的热诱导表位修复（HIER）过程会暴露被掩盖的生物素分子，显著增强其信号，从而使干扰问题变得更加突出。而冰冻切片通常受影响较小。

二、 内源生物素为何会造成实验干扰？

现代生物学实验广泛利用生物素-（链霉）亲和素系统进行信号放大。该系统具有近乎不可逆的结合能力（Kd ≈ 10⁻¹⁵ M）和极高的灵敏度。

• 实验原理：将一抗与生物素标记的二抗（或直接使用生物素化一抗）结合，再加入标记了酶（如HRP、AP）或荧光素的（链霉）亲和素进行检测。
• 问题根源：当组织细胞中含有高水平的内源生物素时，实验中加入的（链霉）亲和素会直接与之结合，即使没有目标蛋白的一抗存在，也会产生强烈的信号，导致背景升高和假阳性。

三、 如何消除内源生物素的干扰：有效阻断方案

解决内源生物素干扰的标准方法是在进行（链霉）亲和素检测之前，使用游离亲和素（Avidin）和生物素（Biotin） 对样本进行预阻断。

标准的“两步阻断法”（适用于HRP/DAB等显色系统）：

1. 亲和素阻断：用游离亲和素（Avidin） 孵育样本，使其与所有内源生物素分子结合位点饱和。
2. 生物素阻断：用游离生物素（Biotin） 孵育样本。游离生物素会与上一步中亲和素分子上剩余的结合位点结合，使其完全饱和。

经过这两步处理后，内源生物素的所有结合位点已被完全占据，后续加入的标记链霉亲和素（Streptavidin） 将无处结合，从而有效消除背景。

重要注意事项与优化策略：

• 试剂选择：

  • 优先使用链霉亲和素/生物素阻断试剂盒，这类试剂盒经过优化，能提供最佳效果。
  • 确保使用未标记的、非活性的亲和素和生物素。

• 实验流程整合：

  • 阻断步骤通常在一抗孵育之后、标记（链霉）亲和素孵育之前进行。
  • 对于免疫组化（IHC），阻断在“抗原修复”后、“一抗孵育”前或后均可，需根据具体实验优化。

• 针对荧光检测的优化：

  • 上述两步法中使用的是未标记的亲和素和生物素。如果您使用荧光标记的链霉亲和素，完成两步阻断后，内源信号已被有效封闭，不会干扰最终检测。
  • 另一种更简便的方法是直接使用预先配制好的“荧光兼容型”内源生物素阻断试剂盒，它们通常一步完成，专为荧光检测优化，避免了可能由游离亲和素/生物素引起的非特异性结合。

• 替代方案：

  • 使用非生物素检测系统：从根本上避免问题。例如，选用直接标记的一抗，或采用HRP/AP直接标记的二抗系统（Polymer聚合物系统），完全跳过生物素-链霉亲和素步骤。

四、 如何判断您的实验是否需要阻断？

1. 设立阴性对照：这是最关键的一步。在实验中设置不加一抗（但进行所有后续步骤，包括生物素二抗和标记链霉亲和素）的对照组。如果该对照组出现阳性信号，则证明存在内源生物素或其他非特异性干扰。
2. 查阅文献：您所研究的组织或细胞类型是否已有报道存在内源生物素问题。
3. 直接测试：如果不确定，最好默认进行阻断，尤其是对肝脏、肾脏、肿瘤等样品。这是一个简单且低成本的保险措施。

总结