标记抗体的活化生物素包括

全面解析：标记抗体常用的活化生物素类型及其选择指南

在免疫学实验（如免疫组化、流式细胞术、ELISA）中，生物素-亲和素系统（Biotin-Avidin System, BAS）因其极高的亲和力和多级放大效应而被广泛应用，能显著提高检测的灵敏度。而这一切的第一步，也是关键的一步，就是如何将生物素有效地“标记”或“连接”到抗体上。这个过程依赖于一类特殊的化学试剂——活化生物素。

本文将全面介绍标记抗体时常用的几种活化生物素，帮助您根据不同的实验需求做出最合适的选择。

为什么需要“活化”的生物素？

生物素本身（维生素H）是一个小分子物质，它虽然能与亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）强力结合，但其本身的羧基（-COOH）化学活性很低，无法直接与抗体上的官能团（如氨基、巯基）高效反应。因此，需要将生物素的羧基进行化学修饰，将其转化为活性更高的中间体，这类中间体就是活化生物素。它们能够与抗体分子上的特定基团形成稳定的共价键，从而完成标记。

常用的活化生物素类型及其特性

根据其活性基团和目标抗体官能团的不同，活化生物素主要分为以下几类：

1. 针对抗体氨基（-NH₂）的活化生物素

抗体分子表面富含赖氨酸的ε-氨基，是最常用的标记位点。这类活化生物素是最主流的类型。

• BNHS (Biotin N-hydroxysuccinimide Ester) 及其衍生物
  • BNHS： 是最经典、最常用的活化生物素。其NHS酯基在弱碱性条件下（pH 7~9）能与抗体上的伯氨基迅速反应，形成稳定的酰胺键。它易于合成和使用，是标记IgG类抗体的首选。
  • Sulfo-NHS-Biotin (磺基-NHS-生物素)： 这是BNHS的水溶性改良版。它在NHS酯基上连接了一个磺酸基团，使其具有良好的水溶性。这意味着标记反应可以在更温和的水溶液中进行，无需先使用有机溶剂（如DMF或DMSO）溶解，减少了有机溶剂对抗体活性的潜在影响，标记效率更高，重现性更好，已成为目前实验室的首选试剂。

2. 针对抗体巯基（-SH）的活化生物素

这类活化生物素用于特异性标记抗体铰链区的巯基。由于抗体上的巯基数量远少于氨基，这种标记方式位点特异性更强，更能保持抗体的活性。

• Biotin-HPDP (N-(6-(Biotinamido)hexyl)-3’-(2’-pyridyldithio)propionamide)： HPDP是一个重要的巯基特异性交联剂。它的一端是生物素，另一端是2-吡啶二硫键。这个二硫键可以与抗体还原后产生的巯基发生交换反应，形成 disulfide 键（-S-S-）。这种标记是可逆的，在还原剂存在下可以断裂，常用于需要纯化或特殊检测的场景。

3. 针对抗体糖基（-CHO）的活化生物素

主要用于标记抗体Fc段的糖链。这种方法通常不直接使用活化生物素，而是先用高碘酸钠（NaIO₄）氧化抗体糖链上的邻二醇生成醛基（-CHO），然后再使用带有酰肼（-NH-NH₂） 基团的生物素试剂进行标记。

• Biotin-LC-Hydrazide： 该试剂上的酰肼基团与抗体被氧化后产生的醛基发生高效的亲核加成反应，形成稳定的腙键。这种方法的优点是标记位点远离抗体的抗原结合位点（Fab段），能最大限度地保护抗体的结合活性。

如何选择合适的活化生物素？

选择哪种活化生物素取决于您的抗体特性、实验目的和标记条件。

通用选择建议：

• 对于大多数初次尝试或常规实验：推荐使用Sulfo-NHS-Biotin。它水溶性好， protocol 成熟，标记效率高，能满足绝大部分实验需求。
• 当担心标记影响抗体抗原结合活性时：可以考虑使用Biotin-HPDP（标记巯基）或Biotin-Hydrazide（标记糖基）进行位点特异性标记，以更好地保护抗体的功能区域。
• 标记 Fab 片段：由于Fab片段缺乏Fc段的糖链和铰链区二硫键，通常只能使用NHS酯类方法标记其氨基。

标记过程中的注意事项

1. pH值： NHS酯类反应需要在pH 7.0-9.0的缓冲液中进行，常用的有PBS（pH 7.4）或硼酸盐缓冲液（pH 8.0-8.5）。避免使用含有氨基的缓冲液（如Tris、甘氨酸），它们会与抗体竞争消耗活化生物素。
2. 温度与时间： 通常在室温或4℃下反应30分钟至2小时。长时间高温反应可能增加抗体聚合的风险。
3. 比例优化： 生物素与抗体的摩尔比需要优化（通常从10：1到40：1不等）。比例过低标记效率不足，比例过高可能导致抗体失活或聚合。
4. 去除游离生物素： 标记反应结束后，必须使用脱盐柱或透析等方法彻底去除未反应的游离生物素，否则会严重干扰后续的检测（竞争结合亲和素）。

总结