标记后生物素太厚了怎么去掉

解决标记后生物素太厚问题：原因分析与处理方案

在免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）或Western Blot等实验过程中，利用生物素-链霉亲和素系统进行放大标记是一种常见且有效的方法。然而，许多研究者都遇到过这样一个棘手的问题：标记后生物素“太厚”，导致背景染色过深、非特异性信号增强，甚至完全掩盖了目标信号。本文将全面分析这一问题的成因，并提供一系列行之有效的解决方案和预防措施。

一、 什么是“生物素太厚”？——问题的表现

“生物素太厚”并非一个标准的科学术语，而是实验人员对以下现象的直观描述：

• 高背景：整个样本（如组织切片或细胞爬片）都被染上颜色，目标信号与背景对比度极低。
• 非特异性染色：非目标区域出现不应有的着色，结果不可信。
• 染色过深：目标信号虽然存在，但因其强度过高而呈“团块状”，无法分辨精细结构，定量分析失准。

其本质是过多的生物素分子与过量的链霉亲和素/亲和素结合，导致信号放大系统失控。

二、 为什么会出现“生物素太厚”？——主要原因分析

1. 生物素化抗体浓度过高：这是最直接的原因。使用的生物素标记的一抗或二抗浓度超出了最佳范围，在组织中引入了过量的生物素。
2. 孵育时间过长或温度过高：延长抗体孵育时间或提高孵育温度，会导致更多抗体非特异性结合，从而引入更多生物素。
3. 内源性生物素干扰：尤其是在组织样本（如肝、肾、脑等）中，本身存在内源性生物素。如果实验前未进行充分的封闭，内源性生物素会与后续加入的链霉亲和素结合，造成普遍性的高背景。
4. 链霉亲和素/亲和素-HRP/荧光染料偶联物过量：信号检测试剂浓度过高或孵育时间过长，会放大所有已结合生物素的信号，包括非特异性结合的信号。
5. 封闭不充分：使用BSA或血清封闭时，未能有效覆盖所有非特异性结合位点，使得抗体和链霉亲和素发生非特异性吸附。

三、 如何“去掉”或减轻太厚的生物素标记？——应急补救方案

当发现标记太厚时，可以尝试以下方法进行补救，但这些方法效果因案而异，预防远比补救更重要。

方案一：稀释重来（最直接的方法）

如果情况允许，最简单的办法是将已标记的生物素化抗体或链霉亲和素试剂用合适的缓冲液（如PBS）进行更高倍数的稀释，重新进行实验。通过降低浓度来减少非特异性结合。

方案二：额外封闭步骤

1. 使用游离亲和素/链霉亲和素进行预封闭：
   • 原理：先用未标记的亲和素处理样本，饱和所有内源性生物素位点。再用游离生物素饱和未标记亲和素上剩余的结合位点，使其无法再与后续标记的链霉亲和素结合。
   • 步骤：
     a. 在加入生物素化抗体之前，用0.1%的未标记亲和素或链霉亲和素溶液孵育样本20-30分钟。
     b. PBS洗涤。
     c. 用0.01%的游离生物素溶液孵育样本20-30分钟，以封闭上一步中亲和素上空余的结合位点。
     d. PBS充分洗涤后，再按正常流程进行后续实验（加入生物素化抗体、标记的链霉亲和素等）。
   • 注意：此方法主要用于克服内源性生物素带来的问题。

方案三：调整检测条件

• 降低DAB显色时间：对于HRP系统，在显色阶段密切监控，一旦目标信号出现立即终止反应（将片子浸入水中），防止背景显色过深。
• 降低荧光染料偶联物的浓度：对于荧光检测，尝试降低链霉亲和素-荧光染料的浓度，并缩短孵育时间。

四、 如何从根本上预防？——优化实验方案

为了避免再次遇到同样的问题，优化实验流程是关键。

1. 进行抗体滴定实验（Titration）：不要直接使用说明书推荐的浓度。为每一个新抗体-样本系统进行棋盘格滴定实验，找到一抗、生物素化二抗、链霉亲和素试剂的最佳工作浓度。通常最终使用的浓度会比说明书推荐的低。
2. 充分封闭：
   • 使用5%正常血清（与二抗同源）或3% BSA进行封闭，时间至少30分钟。
   • 对于富含内源性生物素的组织，务必进行上述的亲和素/生物素封闭步骤。
3. 优化孵育条件：
   • 严格遵守孵育时间和温度。通常在室温或4℃孵育即可，避免在37℃过长时间孵育。
   • 在所有抗体和试剂孵育步骤之间，进行充分且严格的洗涤（通常用PBST洗涤3次，每次5分钟），以洗去未结合的试剂。
4. 设置对照：
   • 阴性对照：省略一抗，只加二抗和检测系统，用于检测二抗的非特异性结合。
   • 空白对照：不加一抗和二抗，只加检测系统，用于检测检测系统本身（如链霉亲和素）的非特异性结合。
   • 这些对照能帮助你快速定位问题出在哪个环节。

五、 替代方案：考虑使用其他检测系统

如果经过多次优化，生物素系统在您的特定样本上仍然背景过高，可以考虑放弃该方案，转向其他同样高灵敏度的非生物素检测系统：

• 直接标记抗体：使用直接偶联了荧光染料或HRP的一抗。
• 聚合物（Polymer）系统：如EnVision™系统，将多个二抗和HRP酶直接偶联到一个惰性聚合物骨架上，灵敏度高且无需生物素-链霉亲和素步骤，可极大避免内源性生物素干扰和非特异性结合。

总结