标记核酸的活性生物素有哪些

全面解析：用于标记核酸的活性生物素及其选择指南

在分子生物学实验中，将核酸（DNA或RNA）进行生物素标记是一项至关重要的技术，广泛应用于基因检测、Southern/Northern印迹、原位杂交、亲和纯化以及新一代测序文库制备等领域。生物素（Biotin）与链霉亲和素（Streptavidin）之间具有极高亲和力（Kd ≈ 10⁻¹⁵ M），这一特性使其成为不可或缺的信号放大与捕获工具。而实现这一标记的关键，在于选择合适的“活性生物素”（Active Biotin），即那些经过化学修饰、带有可反应基团、能够共价连接到核酸上的生物素衍生物。

本文将系统介绍市面上常见的标记核酸的活性生物素种类，并为您提供如何根据实验需求进行选择的实用指南。

一、常见的标记核酸活性生物素种类

活性生物素主要通过其携带的活性基团与核酸分子上的特定官能团发生反应。根据标记方法和目标核酸的不同，主要分为以下几类：

1. 光敏生物素（Photoreactive Biotin）

• 代表物： 光敏生物素乙酸酯（Photobiotin Acetate）
• 反应机理： 其分子中含有一个叠氮基团（Azide Group），在强可见光或紫外光（~350 nm）照射下，该基团会转化为高反应活性的氮烯（Nitrene），后者能无差别地插入核酸碱基的C-H和N-H键中。
• 优点： 操作相对简单，无需复杂的化学处理，即可同时标记DNA和RNA。
• 缺点： 标记效率可能因光照条件而异；可能引起核酸链的断裂或损伤；标记的随机性可能导致某些关键区域被修饰，影响后续杂交效率。

2. 化学修饰法活性生物素
这类方法需要先通过化学手段在核酸上引入特定官能团，然后再与相应的活性生物素反应。

• 标记核苷酸磷酸骨架：

  • 活性基团： 生物素酰肼（Biotin Hydrazide）
  • 反应机理： 先用亚硫酸盐和乙二胺对核酸的胞嘧啶碱基进行转氨基作用，引入羰基，然后生物素酰肼与羰基发生缩合反应形成腙键。
  • 特点： 是一种间接标记法，步骤较为繁琐。

• 标记核酸末端：

  • 活性基团： 生物素琥珀酰亚胺酯（Biotin NHS Ester）
  • 反应机理： NHS酯与伯氨基（-NH₂）在弱碱性条件下高效反应形成稳定的酰胺键。常用于标记合成寡核苷酸的5’端氨基修饰（Aminomodifier C6）或3’端氨基修饰。
  • 优点： 反应高效、专一，标记位点明确（仅在末端），对核酸的内部结构和杂交能力影响最小。是标记探针最常用、最推荐的方法之一。

3. 酶促整合法生物素标记核苷酸
这是在PCR、缺口平移、随机引物标记等酶促反应中最常用的方法。这些生物素标记的核苷酸作为底物被酶（如Taq聚合酶、DNA酶Ⅰ、Klenow片段等）整合到新合成的核酸链中。

• 代表物：
  • 生物素-dUTP（Biotin-11-dUTP, Biotin-16-dUTP）： 最常用，数字11/16表示生物素和核苷酸之间连接臂（Spacer Arm）的原子长度。dTTP的类似物，在合成时被聚合酶当作dTTP使用。
  • 生物素-dATP（Biotin-14-dATP）： 原理同dUTP。
  • 生物素-ddUTP： 用于3’末端标记，例如在TUNEL凋亡检测实验中。
• 优点： 标记效率高、均匀，不影响酶促反应过程，适用于多种实验方案，且可实现多重标记（每个核酸分子标记上多个生物素），增强检测灵敏度。
• 注意： 连接臂的长度至关重要。足够长的连接臂（如16原子）可以减小生物素与链霉亲和素结合时的空间位阻，确保结合效率最大化。

4. 点击化学（Click Chemistry）生物素
这是近年来兴起的新技术，具有高特异性和生物正交性。

• 代表物： DBCO-PEG4-Biotin、Azide-PEG4-Biotin
• 反应机理： 先通过酶促反应将带有DBCO或Azide基团的核苷酸（如EdU、Azido-dUTP）嵌入DNA，再与带有互补基团（Azide或DBCO）的生物素试剂发生高效的点击化学反应。
• 优点： 反应速度快、效率极高、背景低、条件温和，非常适合活细胞内的核酸标记追踪。
• 缺点： 成本相对较高。

二、如何选择合适的活性生物素？

选择哪种活性生物素取决于您的实验目的、标记对象和实验流程：

1. 标记目的：

   • 制备杂交探针（如Southern Blot）： 酶促整合法（Biotin-dUTP） 是最佳选择，可实现高灵敏度标记。
   • 末端标记特定寡核苷酸探针： Biotin NHS Ester 标记5‘/3’氨基修饰的 oligo，是黄金标准，位点明确。
   • 核酸亲和 pull-down： 酶促整合法或NHS末端标记均可，确保标记不影响核酸与目标蛋白的结合能力。
   • 活细胞核酸成像： 点击化学法 是首选。

2. 标记对象：

   • 双链DNA： 所有方法均适用。
   • 单链DNA/RNA： 需谨慎。光敏生物素和酶促法（用于合成cRNA探针）可用，但要注意RNA易降解。NHS酯末端标记对ssDNA也很有效。
   • 合成寡核苷酸： 优先选择在合成时直接引入5‘/3’氨基修饰，然后用NHS酯进行标记。

3. 对核酸完整性的要求：

   • 若要求核酸保持完整活性（如用于体外转录或翻译），应避免可能引起链断裂的光敏标记法，优先选择温和的末端标记或酶促整合法。

4. 对灵敏度（标记密度）的要求：

   • 需要高灵敏度检测时，应选择能实现多重标记的酶促整合法（Biotin-dUTP），每个DNA分子可标记上数十个甚至上百个生物素。
   • 末端标记通常每个核酸分子只标记一个生物素，灵敏度较低，但背景也更干净。

三、实用技巧与注意事项

• 连接臂（Spacer Arm）： 选择生物素试剂时，务必关注其是否含有足够长度的连接臂（如PEG或碳链）。Biotin-XX系列（XX代表原子数）是常见选择，长连接臂能显著提高与链霉亲和素的结合效率。
• 纯化： 标记反应后，必须使用乙醇沉淀、凝胶过滤层析（如G-50柱）或超滤离心等方法去除未结合的生物素和盐离子，否则会严重干扰后续的亲和结合反应，导致高背景或效率低下。
• 检测： 标记效率可通过点杂交（Dot Blot）与系列稀释的已知浓度生物素标记标准品对比，或使用链霉亲和素-HRP/荧光染料结合后进行定量检测。