标记核酸的活化生物素有哪些

全面解析：用于核酸标记的活化生物素及其应用指南

在分子生物学、基因检测和诊断领域，将核酸（DNA或RNA）与生物素进行高灵敏度、高特异性的标记是一项核心技术。标记后的生物素化核酸可通过与链霉亲和素（Streptavidin）或亲和素（Avidin）的强大结合力，被用于检测、捕获和分离。而实现这一标记的关键，就在于选择正确的“活化生物素”。

活化生物素是指生物素分子经过化学修饰后，其羧基基团被转变成各种活性基团（如NHS酯、肼基等），这些活性基团能够与核酸分子上的特定基团（如磷酸基、碱基上的氨基）发生高效反应，形成稳定的共价键。

本文将系统介绍几种常用的标记核酸的活化生物素，并详细阐述其特点、适用场景和选择策略。

一、主要的活化生物素类型及其特点

根据标记原理和靶向的核酸基团不同，常用的活化生物素主要分为以下几类：

1. 光活化生物素（Photoreactive Biotin）

• 代表物： 光敏生物素（Photobiotin）。
• 活化基团： 芳基叠氮化合物。
• 标记原理： 在强可见光（如汞灯）照射下，芳基叠氮基团会转化为高反应活性的氮宾自由基，该自由基能无差别地攻击核酸链上的任何碱基，形成共价结合。
• 优点：
  • 通用性强： 可标记任何类型的核酸（dsDNA, ssDNA, RNA, oligonucleotides）。
  • 操作简单： 混合后光照即可，无需复杂的化学反应。
• 缺点：
  • 非特异性： 随机标记可能导致标记位点影响核酸的杂交效率或功能。
  • 需要特殊设备： 需强可见光源。
  • 标记比例不均一。
• 适用场景： 快速、简单地对大量核酸（如基因组DNA）进行非特异性标记，用于制备杂交探针。

2. 生物素补骨脂素（Biotinylated Psoralen）

• 活化基团： 补骨脂素。
• 标记原理： 补骨脂素在长波紫外线（UVA, 365 nm）照射下，能与核酸（尤其是DNA）中的吡啶碱基（胸腺嘧啶T、尿嘧啶U）发生环加成反应，特异性交联。
• 优点：
  • 特异性较高： 主要靶向T/U碱基丰富的区域。
  • 适用于双链核酸： 尤其适合标记双链DNA（dsDNA），因为补骨脂素可嵌入双链中发生交联。
• 缺点：
  • 需要UVA照射。
  • 标记效率受序列影响（T/U含量）。
• 适用场景： 特异性标记双链DNA，如用于染色体原位杂交、DNA蛋白互作研究等。

3. 生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯（Biotin NHS Ester）

• 活化基团： N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS Ester）。
• 标记原理： NHS酯与伯氨基（-NH2）在弱碱性条件下（pH 7.0-9.0）高效反应，形成稳定的酰胺键。
• 标记靶点： 主要用于标记合成 oligonucleotides 的5‘-端氨基。在核酸化学合成时，可在5‘端引入一个C6或C12氨基 linker，然后使用Biotin NHS酯与之反应。
• 优点：
  • 位点特异性高： 严格标记在5‘端，对探针的杂交能力影响最小。
  • 标记均一： 每个核酸分子携带一个生物素。
  • 反应高效、成熟。
• 缺点：
  • 仅适用于带氨基修饰的合成寡核苷酸，无法直接标记天然核酸。
• 适用场景： 是目前最常用、最可靠的标记合成寡核苷酸探针的方法，广泛应用于PCR、qPCR、微阵列、测序等。

4. 生物素酰肼（Biotin Hydrazide）

• 活化基团： 酰肼（-NHNH2）。
• 标记原理： 酰肼基团与核酸碱基（如胞嘧啶C）上的醛基（-CHO）发生缩合反应。通常需要先用化学方法（如用肼或重亚硫酸盐）处理核酸，使其碱基发生转化并产生醛基。
• 优点： 可用于标记RNA，因为RNA中的C和U在一定条件下容易产生醛基。
• 缺点：
  • 步骤繁琐，需要先对核酸进行化学变性处理。
  • 条件剧烈，可能导致核酸链断裂。
• 适用场景： 主要用于标记RNA，是一种传统的RNA标记方法。

二、如何选择最合适的活化生物素？

选择哪种活化生物素取决于您的实验目的、核酸类型和所需的标记特异性。

• 标记合成的寡核苷酸探针（如PCR引物、捕获探针）：
  首选 Biotin NHS Ester。通过5‘端氨基修饰进行标记，能获得均一、特异、高效的标记产物，性能最可靠。

• 标记长链双链DNA（如PCR产物、基因组DNA）：

  • 若追求简便快捷，可选择 光活化生物素。
  • 若希望有一定的序列特异性（针对T碱基富集区）且保持DNA双链结构，可选择 生物素补骨脂素。

• 标记RNA：

  • 传统方法可使用 生物素酰肼。
  • 更现代的方法包括使用生物素标记的核苷酸（如Biotin-UTP）通过体外转录掺入，或者使用 光活化生物素。

• 需要精确控制标记位点和数量时：
  必须使用 Biotin NHS Ester 对预先引入特定官能团（如氨基）的核酸进行标记。

三、标记后的检测与注意事项

检测方法：
标记成功后，通常使用以下方法进行验证和后续应用：

1. 点杂交（Dot Blot）： 将标记产物点在膜上，使用链霉亲和素-酶（如HRP）或荧光复合物孵育，加入底物进行显色或化学发光检测，是最常用的定性/半定量方法。
2. 电泳迁移率变动分析（EMSA）： 若标记核酸用于研究蛋白结合，可通过链霉亲和素带来的超迁移（supershift）来验证。
3. ELISA/微阵列/测序平台： 直接应用于下游实验，通过系统自身的检测模块读取信号。

注意事项：

1. 纯化： 标记反应后，必须通过乙醇沉淀、柱纯化或凝胶电泳等方法去除未反应的游离生物素，否则会严重干扰后续与链霉亲和素的结合。
2. 保存： 活化生物素极易吸潮水解，应严格遵循说明书，在干燥条件下保存和使用，现用现配。
3. 优化： 首次使用任何活化生物素时，都应进行预实验优化标记反应的条件（如比例、时间、温度），以找到最佳方案。

结论