标记核酸氨基的生物素有哪些

全面解析：用于标记核酸氨基的生物素试剂及选择指南

在分子生物学实验中，如核酸杂交、亲和纯化、病原体检测和下一代测序（NGS）的文库制备中，对核酸（DNA或RNA）进行生物素标记是一项关键的技术。核酸分子上的氨基（主要存在于腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶的碱基上）是进行化学标记的常用位点。本文将全面介绍几种常用的标记核酸氨基的生物素试剂，并为您提供选择和实验上的指导。

一、常见的用于标记核酸氨基的生物素化试剂

这些试剂的核心原理是：其活性酯基团（NHS ester）能够与核酸分子上的伯氨基（-NH2）高效、特异性地反应，形成稳定的酰胺键，从而将生物素分子共价连接到核酸上。

1. 生物素NHS酯 (Biotin N-Hydroxysuccinimide Ester)

   • 简介：这是最经典、最基础的生物素标记试剂。其分子量较小，结构简单。
   • 特点：
     • 需要溶于有机溶剂（如DMF或DMSO）中进行反应，因为它在水溶液中不稳定，会迅速水解失活。
     • 适用于在有机相或有机溶剂/水混合体系中对核酸进行标记。
     • 成本相对较低。

2. 长效臂生物素NHS酯 (Biotinamidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, BXNHS)

   • 简介：在生物素和NHS活性基团之间连接了一个6碳原子的长链间隔臂（“长臂生物素”）。
   • 特点：
     • 减少了空间位阻：长间隔臂使生物素在标记后能够更充分地伸展出来，更容易与体积庞大的亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）结合，显著提高了结合效率和检测灵敏度。
     • 同样需要溶于有机溶剂，水溶性差。
     • 这是在标记核酸时最常用、最推荐的选择之一，因为它很好地平衡了效果和成本。

3. 磺基-NHS-长效臂生物素 (Sulfo-NHS-LC-Biotin)

   • 简介：这是上述长效臂生物素NHS酯的水溶性改良版。其NHS基团上连接了一个磺酸基团（-SO3H），使其带负电荷。
   • 特点：
     • 卓越的水溶性：可直接溶于水或缓冲液中，无需使用有机溶剂，极大方便了实验操作。
     • 反应条件更温和：在水相中与核酸的氨基反应，避免了有机溶剂可能对核酸结构或功能造成的影响。
     • 带负电：磺酸基团的负电荷有助于减少生物素试剂与带负电的核酸骨架之间的非特异性结合，使标记更特异。
     • 通常是标记核酸的首选试剂，尤其是对实验条件要求苛刻或需要避免有机溶剂的场景。

4. 其他衍生物

   • 除了上述常见类型，还有许多其他衍生物，如带有不同长度间隔臂的磺基-NHS-生物素（如Sulfo-NHS-SS-Biotin，带可切割二硫键），以满足特定的实验需求（如需要回收被捕获的生物素化核酸）。

二、如何选择合适的生物素试剂？

选择取决于您的具体实验需求和条件：

• 追求最佳效果和便捷性：首选 磺基-NHS-长效臂生物素 (Sulfo-NHS-LC-Biotin)。它的水溶性和长臂设计使其成为大多数核酸标记实验的理想选择，尤其是用于高灵敏度的检测和亲和纯化。
• 考虑成本因素：如果预算有限，且实验体系可以耐受有机溶剂（如DMF），可以选择 长效臂生物素NHS酯 (BXNHS)。
• 标记后用途：如果生物素化核酸需要用于与固相亲和素结合（如固定在磁珠上的链霉亲和素），必须使用带长间隔臂的试剂（如LC-Biotin或Sulfo-NHS-LC-Biotin），以避免空间位阻导致的结合失败。

三、生物素标记核酸的实验流程与要点

1. 反应原理：生物素NHS酯与核酸链上的伯氨基在弱碱性条件下（pH 7.5-9.0）发生亲核取代反应，形成稳定的共价键。
2. 基本步骤：
   • 将待标记的核酸（通常溶于pH 8.0-8.5的硼酸盐或PBS缓冲液中）准备好。
   • 将生物素试剂（如果是非水溶性的，先用少量DMSO溶解）加入核酸溶液中，涡旋混合。
   • 在室温或37°C下避光反应一段时间（通常30分钟至2小时）。
   • 通过乙醇沉淀、凝胶过滤层析（如G-25柱子）或超滤离心等方法，去除未反应的生物素试剂和副产物，纯化得到生物素化的核酸。
3. 关键注意事项：
   • pH值：反应体系pH值至关重要，必须高于7.0以确保氨基处于去质子化（-NH2）的活性状态。推荐使用pH 8.5的缓冲液。
   • 避光操作：NHS酯对光敏感，反应应在避光条件下进行。
   • 无水环境：对于非水溶性生物素试剂，确保使用的有机溶剂是无水的，并且从密封良好的新瓶中取用DMSO/DMF。
   • 纯化步骤：纯化是必须的，未反应的生物素会竞争性地与亲和素结合，严重干扰后续实验。

四、标记效率的检测

标记完成后，如何验证是否成功？常用方法有：

• 点杂交法 (Dot Blot)：将生物素化核酸点到膜上，与链霉亲和素-HRP conjugate孵育，再加入化学发光底物显影，通过信号强度判断标记效率。
• 光谱分析法：利用生物素在特定波长下的吸光度特性进行估算（需要精确计算浓度）。
• 4’-羟基偶氮苯-2-羧酸 (HABA) / 亲和素检测法：一种基于吸光度变化的定量方法，可精确计算每个核酸分子上连接的生物素数量。

总结：