标记的抗生物素有哪些

标记的抗生物素全面解析：种类、应用与选择指南

在生命科学研究和体外诊断领域，放大信号、提高检测灵敏度是实验成功的关键。抗生物素（Avidin） 和它的“升级版” 链霉亲和素（Streptavidin） 与生物素（Biotin）之间高达10^(-15) M的结合常数，是自然界中最强的非共价相互作用之一。因此，“标记的抗生物素” 成为了连接靶点分子与检测信号的“万能桥梁”和核心工具。

本文将系统介绍市面上常见的标记抗生物素种类，并深入探讨其应用场景和选择策略，助您为实验找到最合适的“金钥匙”。

一、 常见的标记抗生物素有哪些？

标记抗生物素，顾名思义，是指通过化学方法将报告分子（如酶、荧光素等）共价连接到抗生物素或链霉亲和素上所形成的复合物。根据标记物的不同，主要分为以下几大类：

1. 酶标记抗生物素
这是应用最广泛的一类，主要用于免疫组化（IHC）、Western Blot（WB）、ELISA等需要酶促反应放大信号的实验。

• 辣根过氧化物酶标记（HRP-Conjugated）：最常用的标记之一。HRP催化底物（如DAB、TMB）产生颜色沉淀或发光信号，灵敏度高，成本相对较低。
• 碱性磷酸酶标记（AP-Conjugated）: 另一个常用标记。AP催化底物（如BCIP/NBT）产生颜色沉淀，或在化学发光体系中发光。其活性在有些条件下比HRP更稳定。
• β-半乳糖苷酶标记（β-Galactosidase-Conjugated）：应用相对较少，主要用于一些特定的实验体系。

2. 荧光标记抗生物素
主要用于荧光检测技术，如免疫荧光（IF）、流式细胞术（Flow Cytometry）、荧光原位杂交（FISH）等。

• FITC标记：发射绿色荧光（~520 nm），是最经典和常用的荧光标记之一。
• PE标记（藻红蛋白）：非常明亮，发射橙黄色荧光（~575 nm），在流式细胞术中能提供极强的信号。
• Cy3、Cy5、Cy7等标记：这类花菁染料荧光亮度高，光稳定性好，发射光谱覆盖红光到近红外区域，非常适合多色标记实验和降低背景干扰（生物样本自身荧光在近红外区较弱）。
• Alexa Fluor系列（如 Alexa Fluor 488, 555, 647等）：这类染料是人工合成的，具有比传统染料更明亮、更光稳定、对pH不敏感等优点，是目前的高端首选。

3. 生物素标记抗生物素
这是一种特殊的“标记”，主要用于信号放大系统（如ABC法）。通过使用预先形成的抗生物素-生物素化酶复合物，一个酶分子可以通过多个生物素位点与多个生物素化二抗结合，实现信号的级联放大，显著提高检测灵敏度。

4. 胶体金/纳米金颗粒标记
主要用于免疫电镜和侧向层析试纸条（如早孕试纸）等。金颗粒在光学显微镜下呈红色，在电镜下具有高电子密度，可直接观察。

5. 其他标记物

• 同位素标记（如¹²⁵I）：用于放射免疫分析（RIA），目前已较少使用。
• 生物素结合蛋白衍生物：如 NeutrAvidin™（中性抗生物素，去糖基化且电荷修饰）和 CaptAvidin™（可逆结合型），它们旨在克服普通抗生物素（Avidin）高pI值导致的非特异性结合问题，提供更低的背景。

核心成员对比：Avidin vs. Streptavidin

• 抗生物素（Avidin）：提取自鸡蛋清，是一种糖基化蛋白，等电点（pI）高达10.5。在高pI下容易与带负电的细胞表面分子（如磷脂）发生非特异性结合，导致背景较高。
• 链霉亲和素（Streptavidin）：来源于阿维丁链霉菌，非糖基化，pI接近中性（~6.5），因此非特异性结合远低于Avidin，是现代实验中的首选。我们通常所说的“标记抗生物素”，绝大多数情况下指的是“标记的链霉亲和素”。

二、 如何选择正确的标记抗生物素？

选择取决于您的实验目的、检测系统和想要的结果。

1. 根据检测方法选择标记物：

   • 显色/发光检测（WB, IHC, ELISA）：选择 HRP 或 AP 标记。
   • 荧光成像/流式检测：选择 荧光染料（FITC, PE, Alexa Fluor系列） 标记。多色实验时注意染料之间的光谱重叠。
   • 电镜或层析检测：选择 胶体金 标记。
   • 需要极致灵敏度：考虑使用 生物素标记的抗生物素 来组建ABC放大系统。

2. 优先选择链霉亲和素（Streptavidin）：
   除非有特殊原因，否则始终优先选择基于链霉亲和素的产品，以获得最低的背景和最高的信噪比。对于组织内源性生物素含量高的样本（如肝脏、肾脏、乳腺等），NeutrAvidin™是更好的选择。

3. 考虑 conjugate 的形式：

   • 液体形式：使用方便，通常已优化好浓度，即开即用。
   • 冻干粉形式：更稳定，便于长期储存，但使用前需要精确复溶。

三、 实验技巧与注意事项

• 封闭是关键：使用基于生物素/抗生物素的系统时，必须用不含生物素的封闭剂（如BSA、血清、Casein等）。普通脱脂牛奶含有生物素，会造成高背景，应避免使用。
• 优化稀释度：产品推荐浓度是一个起点，需要进行梯度稀释实验以找到最佳信噪比的工作浓度。
• 控制内源性干扰：
  • 内源性生物素：在IHC中，某些组织存在内源性生物素，需要通过热修复或使用内源性生物素封闭试剂盒进行阻断。
  • 内源性酶：使用HRP系统时，需用H₂O₂甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶；使用AP系统时，可用左旋咪唑阻断内源性碱性磷酸酶。
• 保存条件：酶标记物（尤其是HRP）对光和温度敏感，应按照说明书要求避光保存在4℃或-20℃。反复冻融会导致活性下降，建议分装储存。

结论

标记的抗生物素和链霉亲和素是现代生物技术工具箱中不可或缺的强大工具。从经典的酶标到先进的多色荧光，它们为各种检测应用提供了高效、灵敏的解决方案。