标记氨基和核酸的生物素有哪些

全面解析：用于标记氨基与核酸的生物素试剂选择指南

在分子生物学、细胞生物学和诊断技术领域，生物素-亲和素系统因其极高的亲和力（Kd ≈ 10⁻¹⁵ M）和放大效应，成为标记、捕获和检测目标分子的“黄金标准”。其中，选择正确的生物素化试剂是实验成功的第一步。本文将为您详细梳理用于标记蛋白质氨基和核酸的各类生物素试剂，并提供实用的选择指南。

一、 用于标记氨基（蛋白质或多肽）的生物素试剂

蛋白质或多肽上的伯氨基（-NH₂，如赖氨酸侧链和N末端）是最常见的生物素化位点。针对这一靶点，主要有以下几类试剂：

1. NHS酯类生物素
这是最经典、使用最广泛的氨基标记试剂。

• 原理：活化酯（N-羟基琥珀酰亚胺酯）与伯氨基在温和的碱性条件下（pH 7-9）反应，形成稳定的酰胺键。
• 常见试剂：
  • Biotin NHS (Succinimidyl ester)：标准试剂，适用于大多数情况。但疏水性较强，可能影响某些蛋白质的溶解度。
  • Sulfo-NHS-Biotin：是NHS-Biotin的水溶性改良版。因其增加了磺酸基团（-SO₃⁻），水溶性极佳，无需有机溶剂（如DMSO）助溶，避免了有机溶剂可能使蛋白质变性的风险。是标记细胞表面蛋白的首选试剂，因为它无法穿透细胞膜，只能标记细胞外区域的蛋白。
• 特点：标记速度快、效率高、应用广泛。

2. 长臂连接臂生物素（LC-Biotin, Long Chain）

• 原理：在生物素分子和反应基团（如NHS酯）之间连接一个较长的 spacer arm（如6-氨基己酸）。
• 常见试剂：Biotin-LC-NHS, Biotin-XX-NHS (XX代表更长的连接臂)。
• 特点：长连接臂减少了生物素大分子空间位阻对亲和素结合的影响，能显著提高检测灵敏度，尤其是在目标蛋白上的生物素化位点空间上难以接近时。强烈推荐用于标记膜蛋白或空间结构复杂的蛋白。

3. 胺反应性、可切割生物素

• 原理：在生物素和蛋白质之间引入一个可被特定条件断裂的化学键。
• 常见试剂：
  • Sulfo-NHS-SS-Biotin：含二硫键，可用还原剂（如DTT、β-巯基乙醇）切割。广泛应用于细胞表面蛋白的分离和纯化，标记后可用亲和素珠捕获，再用还原剂将目标蛋白洗脱下来。
  • 其他可切割类型：还包括可被酶切、光解或酸解的连接臂。
• 特点：为下游的纯化、回收实验提供了极大的灵活性。

二、 用于标记核酸（DNA/RNA）的生物素试剂

核酸本身没有伯氨基，因此标记策略与蛋白质不同，主要通过酶促掺入或化学修饰实现。

1. 酶促掺入法
这是最常用、最温和的方法，通过酶反应将带有生物素标记的核苷酸类似物掺入到核酸链中。

• 原理：
  • 缺口平移 (Nick Translation)、随机引物标记 (Random Priming)、PCR标记：使用 Biotin-dUTP 或 Biotin-dCTP 代替相应的未标记核苷酸，在DNA聚合酶的作用下掺入新合成的DNA链。
  • 体外转录 (In Vitro Transcription)：使用 Biotin-UTP 或 Biotin-CTP 来合成生物素标记的RNA。
  • 末端标记 (End-labeling)：使用末端转移酶（TdT）将 Biotin-ddUTP 加到DNA的3’末端。
• 特点：标记效率高、对核酸损伤小、可控制标记密度和位置（如仅末端标记），是制备杂交探针的首选方法。

2. 化学标记法
适用于合成好的寡核苷酸或无法进行酶促反应的场景。

• 原理：使用带有活性基团的生物素试剂与经过化学修饰的核酸反应。
• 常见试剂：
  • 生物素亚磷酰胺 (Biotin Phosphoramidite)：在寡核苷酸化学合成仪上直接将其连接到链的5’末端或3’末端，或内部任何位置。这是标记合成 oligo 的最标准方法。
  • 标记修饰基团：先通过其他方法在核酸上引入一个“手柄”，再用相应的生物素试剂去抓取。
    • 氨基修饰（Amine-modified）：在合成 oligo 时引入一个C6氨基等修饰，然后使用 NHS酯类生物素（如Biotin-NHS）进行标记，与蛋白质标记原理类似。
    • 巯基修饰（Thiol-modified）：引入巯基（-SH），使用 Maleimide-activated Biotin (生物素-马来酰亚胺) 进行标记。
• 特点：位置精确、适用于各种修饰寡核苷酸，但可能需要额外的纯化步骤。

三、 如何选择正确的生物素试剂？——综合指南

面对众多选择，您可以遵循以下决策流程：

1. 明确标记目标：

   • 标记蛋白质（特别是细胞表面蛋白）：首选 Sulfo-NHS-LC-Biotin（兼顾水溶性和长臂效应）。
   • 标记可溶性蛋白/抗体：NHS-Biotin 或 NHS-LC-Biotin 通常足够。
   • 需要后续纯化回收目标蛋白：选择 Sulfo-NHS-SS-Biotin 等可切割生物素。
   • 标记核酸（DNA/RNA）：
     • 对于长链核酸探针：首选 酶促掺入法（使用 Biotin-dUTP 等）。
     • 对于合成的寡核苷酸：首选在合成时使用 生物素亚磷酰胺 或合成后使用 NHS酯标记氨基修饰的Oligo。

2. 考虑空间位阻：如果担心生物素分子被目标分子或其他结构遮蔽，影响与亲和素的结合，务必选择带有长连接臂（LC或XX）的试剂。

3. 考虑水溶性与膜透性：

   • 标记水溶性差的蛋白，或为避免使用有机溶剂，选 Sulfo-NHS-XX-Biotin。
   • 只想标记细胞表面蛋白，选水溶性且膜不通透的 Sulfo-NHS-XX-Biotin。
   • 想标记细胞内蛋白，则需要使用膜通透性的试剂（如某些特殊的酯类），或先对细胞进行透化处理。

4. 阅读产品说明书：不同厂商的试剂在纯度、溶解性和推荐反应条件上可能有细微差别，遵循说明书是成功的关键。

总结：