白化生物素有哪些

一文读懂“白化生物素”：种类、选择指南与实验方案

在生命科学和生物化学研究领域，特别是涉及蛋白标记、检测和纯化的实验中，“白化生物素”是一个至关重要的工具。当您搜索这个关键词时，很可能正为实验方案寻找合适的试剂或希望深入了解其应用。本文将系统性地介绍白化生物素的种类、特性及其应用，助您做出最佳选择。

一、什么是“白化生物素”？—— 并非一种单一物质

首先需要明确一个概念：“白化生物素”并非特指某一种单一的化合物，而是一类生物素衍生物或类似物的统称。它们共同的核心特点是降低了与链霉亲和素（Streptavidin）或亲和素（Avidin）的结合能力。

• 为什么需要“白化”？
  传统的生物素（Biotin）与链霉亲和素之间的结合是自然界中最强的非共价相互作用之一（Kd ~ 10^-15 M），这种结合几乎是不可逆的。这在诸如ELISA、Western Blot等检测实验中是巨大优势。
  然而，在某些应用中，这种不可逆结合会带来问题，例如：
  • 亲和纯化中需要温和洗脱：在纯化生物素化的蛋白或复合物时，无法在不变性蛋白的条件下将目标物从链霉亲和素珠上洗脱下来。
  • 细胞表面标记物的可逆标记：希望临时标记细胞，之后又能将其解离，以便进行后续功能研究。
  • 降低非特异性背景：极强的结合可能导致一些非特异性结合难以被洗掉。

“白化生物素”正是为了解决这些问题而设计的。它们与亲和素蛋白的结合力被有意削弱，使其结合变得可逆。

二、常见的“白化生物素”种类及其特性

市面上有多种商业化的“白化生物素”试剂，以下是几种最常见和重要的类型：

1. 生物素-XX SSE（磺基琥珀酰亚胺酯）

   • 特点：这可能是最常用的一种“白化生物素”试剂。这里的“XX”代表了一个延长的 linker（间隔臂），增加了与亲和素结合位点的空间距离，从而显著降低其亲和力（Kd ~ 10^-7 M）。它是水溶性的，并且带有胺反应性基团（NHS酯），可高效标记蛋白的赖氨酸（Lys）残基或任何带有伯胺的分子。
   • 应用：可逆性蛋白标记和纯化的黄金标准。在酸性条件下（如pH 4.0）或用高浓度的游离生物素竞争，可以轻松地将结合的物质洗脱下来。

2. 2-Iminobiotin（2-亚氨基生物素）

   • 特点：这是生物素的一种结构类似物。其结合亲和力强烈依赖于pH值。
     • 在碱性条件下（pH 9-11）：它以带电形式存在，与链霉亲和素结合较强。
     • 在酸性条件下（pH 4.0）：它转变为中性形式，与链霉亲和素的结合极大减弱，可以轻松被洗脱。
   • 应用：非常适合用于pH控制的亲和纯化。在碱性上样和结合，在酸性条件下洗脱，条件非常温和。

3. Desthiobiotin（脱硫生物素）

   • 特点：它是生物素的另一种类似物，只是缺少了硫原子。它与链霉亲和素的亲和力（Kd ~ 10^-11 M）比传统生物素弱得多，但又比上述两种强一些。其结合是可逆的，可以被高浓度的游离生物素竞争性洗脱。
   • 应用：在需要较高结合力但又必须可逆洗脱的场景中非常有用。特别受欢迎于链霉亲和素包被的磁珠用于纯化生物素化的核酸或蛋白，洗脱条件温和，能保持目的分子的活性。

4. 生物胞素（Biocytin）

   • 特点：生物胞素是生物素通过酰胺键与赖氨酸相连的化合物。它本身与链霉亲和素的结合力依然很强。但它常被归为“白化”相关试剂，因为它的主要用途是作为细胞可穿透的生物素衍生物。一旦进入细胞，会被细胞内酯酶水解，释放出生物素，从而标记细胞内源蛋白。
   • 应用：主要用于细胞内标记，而非严格意义上的“可逆结合”。

三、如何选择适合的“白化生物素”？

您的选择应完全基于实验目的：

• 目标是进行可逆的亲和纯化吗？

  • 首选【生物素-XX SSE】：适用性最广，洗脱方案成熟（低pH或生物素竞争）。
  • 考虑【2-亚氨基生物素】：如果您的目标分子能够耐受pH的剧烈变化，这是一个非常干净的选择。
  • 考虑【脱硫生物素】：如果您希望结合力稍强一些，减少非特异性洗脱，并且用游离生物素竞争洗脱。

• 目标是标记细胞膜蛋白并希望后续能解离吗？

  • 首选【生物素-XX SSE】：用于细胞表面胺基的标记，完成后可用酸性缓冲液或含生物素的缓冲液处理细胞，将未内化的生物素标签移除。

• 目标是标记细胞内蛋白吗？

  • 首选【生物胞素】：让其穿透细胞进行标记。

四、实验流程简要指南（以生物素-XX SSE为例）

1. 标记：将生物素-XX SSE与您的目标蛋白（或细胞）在适当的缓冲液（pH 7-9，不含胺如Tris、甘氨酸）中孵育，使其发生反应。
2. 纯化：通过脱盐柱或透析去除未反应的生物素试剂。
3. 结合：将生物素化的样品与链霉亲和素琼脂糖珠（或磁珠）孵育，使目标物结合到珠子上。
4. 洗涤：用中性缓冲液彻底洗涤珠子，去除杂质。
5. 洗脱：使用洗脱缓冲液（如100 mM甘氨酸-HCl，pH 2.8-3.0）处理珠子，收集洗脱液。并立即用中和缓冲液（如1M Tris-HCl, pH 9.0）中和洗脱液，以保持蛋白活性。 Alternatively，可以使用含2-10 mM游离生物素的缓冲液进行竞争性洗脱。

五、知名供应商推荐

购买高质量的试剂是实验成功的关键。国际知名的供应商包括：

• Thermo Fisher Scientific（其旗下品牌Invitrogen和Pierce提供多种类的此类试剂，如产品号 #21329 (Biotin-XX SSE)）
• Sigma-Aldrich（默克）
• Cayman Chemical
• TOYOBO

在购买时，请务必查阅产品说明书，确认其溶解度、反应特性、分子量和推荐的保存条件。