荧光原位杂交（FISH）技术自问世以来已成为分子生物学和细胞遗传学研究中不可或缺的工具。其中，生物素标记系统作为FISH技术中最经典的标记方法之一，至今仍在许多实验室广泛应用。本文将全面解析FISH技术中生物素标记的原理、流程、应用及常见问题解决方案。
生物素是一种小分子维生素，具有与亲和素或链霉亲和素高效结合的特性（结合常数高达10^15 M^-1）。在FISH实验中，通常将生物素标记的核苷酸（如Biotin-11-dUTP）通过分子生物学方法掺入DNA探针中。杂交后，加入荧光标记的亲和素或链霉亲和素，它们会特异性识别并结合生物素标记的探针，从而在显微镜下产生可见的荧光信号。
这种系统的优势在于其极高的亲和力和特异性，同时通过信号放大步骤可以检测到较弱的靶序列。信号放大通常通过使用生物素化的抗亲和素抗体 followed by 额外的荧光标记亲和素来实现，能够显著增强检测灵敏度。
探针标记通常采用尼克翻译法或PCR法引入生物素标记的核苷酸。标记后的探针需要经过纯化以去除未掺入的核苷酸，常用方法包括乙醇沉淀、柱纯化或磁珠纯化。
细胞或组织样本需要经过固定、透化处理，并使用蛋白酶适度消化以增加细胞膜和核膜的通透性，使探针能够到达靶核酸。
将变性的探针与变性的样本在适宜温度下杂交通常过夜，允许探针与互补序列特异性结合。
杂交后洗去未结合探针，然后加入荧光标记的亲和素进行检测。如需信号放大，可继续进行抗体孵育和二次检测。
最后在荧光显微镜下观察结果，使用适当的滤镜组观察荧光信号，并进行图像采集和分析。
高背景信号：
信号弱或无信号：
非特异性信号：
生物素标记FISH技术在多个领域发挥着重要作用：
临床诊断：
基础研究：
进化生物学：
虽然生物素标记系统非常有用，但近年来直接荧光标记探针的使用越来越广泛，特别是在需要多色FISH或快速检测时。直接标记法减少了实验步骤，降低了背景，但成本较高且灵敏度有时略低。
新技术如CRISPR-FISH和 oligopaint FISH 也开始采用生物素-亲和素系统进行高效检测，显示了这一经典系统在现代分子生物学中的持续价值。
生物素标记系统在FISH技术中经历了时间考验，尽管新技术不断涌现，它仍然因其可靠性、经济性和高灵敏度而在许多实验室保持着重要地位。成功的关键在于理解其原理，优化实验条件，并根据具体研究问题选择合适的标记和检测策略。随着多组学时代的到来，生物素标记FISH技术仍将继续为基因组结构和功能研究提供宝贵的技术支持。
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