用活化生物素标记的物质不包括

活化生物素标记：哪些物质无法被标记？全面解析与解决方案

在免疫学、分子生物学和细胞学实验中，生物素-亲和素系统因其极高的亲和力和放大效应而被广泛应用。其中，活化生物素（如NHS-Biotin, Sulfo-NHS-Biotin） 是标记各类物质的起点。许多科研人员在设计实验时，常会搜索“用活化生物素标记的物质不包括哪些”，其核心目的是为了规避实验风险，确保标记成功。本文将全面解答这一问题，并为您提供清晰的指南和解决方案。

一、首先，理解活化生物素的标记原理

要明白“哪些不能标记”，首先要清楚“为什么能标记”。最常见的活化生物素（如NHS酯类）是通过与目标分子上的伯氨基（-NH₂） 发生共价反应来实现标记的。这些伯氨基主要存在于：

• 蛋白质/抗体：赖氨酸（Lysine）残基的ε-氨基是主要的反应位点。
• 多肽：末端的α-氨基和链中的赖氨酸氨基。
• 核酸：通常需要通过改造，在链的5’或3’端引入一个伯氨基，才能与活化生物素有效结合。

因此，任何缺乏可供反应的伯氨基，或其伯氨基被严重遮蔽、所处环境不适的生物分子，都可能成为“无法被有效标记”的物质。

二、无法或用活化生物素难以标记的物质清单

基于上述原理，以下类别的物质通常被排除在标准的NHS-活化生物素标记方案之外：

1. 缺乏伯氨基（-NH₂）的小分子或化合物

• 典型例子：大部分糖类（如葡萄糖、蔗糖）、脂类（如胆固醇、甘油三酯）、固醇类激素等。这些分子的结构仅由羟基、羧基、醛基或酮基构成，缺乏能与NHS酯反应的伯氨基。
• 例外情况：如果某些小分子（如某些药物分子）本身含有伯氨基，则可以直接标记。

2. 核酸（DNA/RNA）

• 核心原因：天然的DNA和RNA的碱基（A, T, C, G, U）和糖磷酸骨架缺乏易于反应的伯氨基。虽然碱基上存在一些含氮基团，但它们通常不参与这种类型的反应，且反应会破坏核酸的完整性和杂交能力。
• 标准方法：因此，标记核酸通常不直接使用活化生物素，而是采用：
  • 酶学法：使用生物素标记的核苷酸（如Bio-dUTP）通过PCR、缺口平移或末端标记酶促掺入。
  • 化学法：先对核酸进行化学修饰（例如，引入氨基修饰基团），再用活化生物素进行标记。

3. 空间位阻大或活性氨基被包埋的蛋白质

• 核心原因：有些蛋白质的赖氨酸残基深埋在其三维结构内部，或位于疏水核心区，无法与水溶性的活化生物素试剂接触。强酸性的蛋白质也可能因为其周围环境的排斥作用而难以反应。
• 影响：这会导致标记效率极低，甚至标记失败。即使强行标记，也可能破坏蛋白质的空间结构，导致其失活。

4. 活性氨基为功能关键位点的蛋白质

• 核心原因：如果某个赖氨酸残基恰好是酶的活性中心、抗原的抗体的结合位点（表位）或受体的配体结合域，对其进行生物素化会直接掩蔽或破坏其生物活性。
• 后果：标记虽然成功了，但得到的生物素化产物却失去了功能，实验自然失败。

5. 处于不适pH缓冲体系中的物质

• 核心原因：NHS酯与伯氨基的反应需要在弱碱性条件下（pH 7.0-9.0） 进行，以确保氨基处于去质子化的活性状态（-NH₂而非-NH₃⁺）。
• 无法标记的情况：如果目标物质溶解或保存在强酸性缓冲液（如含有柠檬酸、甘氨酸-HCl的缓冲液）或含有氨基的缓冲液（如Tris, Glycine）中，标记反应将无法进行或效率极低。Tris等缓冲液会与活化生物素快速反应，消耗掉标记试剂。

三、解决方案与替代策略

如果您需要标记上述“难题”物质，请不要灰心，可以尝试以下策略：

1. 对于缺乏伯氨基的小分子/化合物：

   • 化学衍生化：先通过化学反应在分子上引入一个“ linker”，这个linker另一端带有伯氨基，然后再用活化生物素进行标记。

2. 对于核酸：

   • 采用标准酶标法：这是最常用、最高效的方法，优先选择。
   • 购买预标记的探针：许多公司提供即用型的生物素标记核酸探针。

3. 对于难标记的蛋白质：

   • 变性后标记：先用变性剂（如GuHCl, Urea）温和地打开蛋白质空间结构，暴露被包埋的氨基，标记后再通过透析复性。
   • 使用不同基团的活化生物素：如果伯氨基是功能关键位点，可以尝试使用能与其他官能团反应的活化生物素变体，例如：
     • 马来酰亚胺活化生物素：与巯基（-SH，半胱氨酸残基）反应。
     • 肼活化生物素：与糖链上的醛基（-CHO）反应，适用于标记糖蛋白。
   • 优化标记条件：严格控制反应pH（使用PBS或碳酸盐缓冲液，避免Tris），并在低温下短时反应以减少对蛋白活性的影响。

4. 通用注意事项：

   • 纯化：标记前对目标物质进行透析或脱盐，确保其处于适合反应的缓冲体系中。
   • 试剂选择：Sulfo-NHS-Biotin水溶性更好，更适合标记水溶液中的蛋白质，且细胞膜不透性，常用于细胞表面蛋白标记。

总结

总而言之，用活化生物素无法直接标记的物质主要包括：缺乏伯氨基的小分子、天然核酸、以及因空间结构或功能关键性而导致其伯氨基无法使用的蛋白质。