用什么菌测生物素

微生物法测定生物素：原理、常用菌种与标准流程详解

在食品工业、制药业和营养研究领域，准确测定样品中的生物素（维生素B7或维生素H）含量至关重要。在众多检测方法中，微生物法因其高特异性、高灵敏度和与经济性而被视为黄金标准。那么，究竟用什么菌来测定生物素？其背后的原理和操作流程又是怎样的？本文将为您全面解析。

一、核心答案：用什么菌测生物素？

最常用于测定生物素的菌种是 阿拉伯乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum），旧称阿拉伯聚糖乳杆菌（Lactobacillus arabinosus），菌种编号通常为ATCC 8014。

选择该菌种的原因在于：

1. 高度专一性：阿拉伯乳酸杆菌的生长绝对依赖于外源性生物素的供应，它对生物素的反应非常灵敏且特异，几乎不受样品中其他B族维生素或复杂基质的干扰。
2. 剂量效应关系明确：在特定浓度范围内，该菌的生长量（以浊度表示）与生物素的含量呈良好的线性关系，这使得定量分析非常准确。
3. 应用广泛：该方法被AOAC（国际官方分析化学家协会）、USP（美国药典）等众多权威机构收录为标准方法，用于检测药品、食品、饲料等多种样品。

除了阿拉伯乳酸杆菌，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 的一些特定菌株也曾被用于生物素测定，但其特异性和准确性通常不如乳酸杆菌，因此现在应用较少。

二、微生物法测定生物素的原理

该方法的理论基础是微生物定量分析。

1. 依赖关系：选用的菌株（如阿拉伯乳酸杆菌）自身不能合成生物素，必须从外界环境中摄取才能生长繁殖。
2. 标准曲线：首先，准备一系列含有已知梯度浓度生物素（标准品）的培养液。将菌种接种到这些试管中，在适宜的温度（通常37℃）下培养一段时间（通常16-24小时）。
3. 生长指标测量：菌株的生长量通过测量培养液的浊度（吸光度OD值） 来确定。生物素浓度越高，细菌生长越旺盛，溶液就越浑浊，测得的OD值也越高。
4. 样品测定：在相同条件下，将菌种接种到含有待测样品（需经过预处理提取生物素）的培养液中，培养后测量其浊度。
5. 计算含量：将样品管的OD值与标准曲线进行比对，即可计算出待测样品中生物素的准确含量。

三、标准操作流程（SOP）简述

以阿拉伯乳酸杆菌（ATCC 8014）为例，流程如下：

1. 准备工作：

• 菌种复苏与保藏：将冻干菌种接种于乳酸杆菌琼脂培养基（MRS培养基）上进行复苏和活化，确保菌种活力。
• 培养基配制：使用不含生物素的基础培养基，所有玻璃器皿需彻底清洁，防止微量营养素的污染。
• 标准溶液配制：精确配制生物素标准储备液和工作液，形成一系列浓度梯度（如0.0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 pg/mL）。

2. 样品预处理：

• 样品需经过酶解（如木瓜蛋白酶）、酸解或碱解处理，释放出结合形式的生物素，使其转化为游离态，才能被微生物利用。
• 提取后调节pH至中性，并进行适当稀释，使其浓度落在标准曲线的线性范围内。

3. 接种与培养：

• 向一系列试管中分别加入标准液和处理后的样品液，再加入无菌的基础培养液。
• 所有试管经高压灭菌后，冷却至室温，在无菌条件下接种一小滴（约50μL）制备好的菌悬液。
• 在37℃恒温培养箱中培养16-24小时。

4. 测量与计算：

• 使用分光光度计，在540-660nm波长下测量每管培养液的吸光度（OD值）。
• 以标准品浓度的对数为横坐标（X轴），对应的OD值为纵坐标（Y轴），绘制标准曲线。
• 将样品管的OD值代入标准曲线的回归方程，计算出样品中生物素的浓度，再乘以稀释倍数，即可得到原始样品中的含量。

四、方法优势与局限性

优势：

• 高灵敏度：可检测出皮克（pg）级别的生物素。
• 高特异性：主要检测具有生物活性的D-生物素，结果能真实反映样品的营养价值。
• 成本较低：相对于昂贵的HPLC-MS仪器，设备投入小。

局限性：

• 流程繁琐耗时：从样品预处理到培养出结果，通常需要2-3天。
• 技术要求高：需要严格的无菌操作技术，否则易染菌导致实验失败。
• 影响因素多：培养温度、接种量、pH等都会影响结果，需要精细控制。
• 无法区分同系物：只能测定总生物活性，不能区分生物素及其类似物。

五、其他检测方法简介

除了微生物法，现代实验室也采用其他方法作为补充：

• 高效液相色谱法（HPLC）：速度快，自动化程度高，但通常需要复杂的衍生化步骤以提高检测灵敏度，且设备昂贵。
• 酶联免疫吸附法（ELISA）：使用特异性抗体，操作相对简单，适合大批量样品快速筛查，但可能存在交叉反应，抗体成本高。
• 液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）：是目前最灵敏、最特异的方法，能够准确定量和确认结构，是高端研究的首选，但仪器成本和维护费用极高。

总结：