氨基与生物素反应的四种反应

作者：小编更新时间：2025-08-27

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在生物化学、分子生物学和药物研发领域，生物素（Biotin）与亲和素（Streptavidin）或抗生物素蛋白（Avidin）之间近乎不可逆的结合能力，使其成为了最强大的分子工具之一。而将生物素连接到目标分子（如蛋白质、抗体、核酸）上的过程，称为生物素化（Biotination）。

其中，针对分子上的氨基（-NH₂）（尤其是蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基或分子末端的α-氨基）进行反应，是最经典、应用最广泛的策略。本文将深入探讨四种关键的基于氨基的生物素化反应，助您全面掌握其原理、特点与应用选择。

这是目前最常用、最可靠的生物素化方法。

反应原理：生物素分子上的羧基（-COOH）首先被活化，形成N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS Ester）。该活化酯在弱碱性条件下（pH 7.5-9.0）会与靶分子上的伯氨基发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键，同时释放N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。
反应式示意：
Biotin-NHS + Target-NH₂ → Biotin-NH-Target + NHS
优点：
- 反应高效：条件温和，在水溶液中即可进行，反应速度快。
- 特异性高：主要靶向伯氨基，副反应少。
- 产物稳定：生成的酰胺键非常稳定，不易水解。
缺点：
- pH敏感：需要在无氨基的缓冲液（如PBS、碳酸盐缓冲液）中进行，避免Tris等含氨基缓冲液的干扰。
- 可能影响活性：如果标记位点位于蛋白质的关键活性位点，可能会影响其生物活性。
应用场景：适用于绝大多数蛋白质、抗体的常规标记。市面上常见的“生物素标记试剂盒”大多采用此原理。

磺基-NHS酯是NHS酯的改良版本，解决了其水溶性差的关键问题。

反应原理：其原理与NHS酯完全相同，都是在碱性条件下与伯氨基反应形成酰胺键。不同之处在于，磺基-NHS酯分子上带有一个磺酸基团（-SO₃H），使其水溶性极大提高。
优点：
- 水溶性好：无需先用有机溶剂（如DMF、DMSO）溶解，可直接在水相反应体系中加入，操作更简便，标记更均匀。
- 膜不透性：由于带有电荷，通常无法穿过细胞膜，因此特别适合用于细胞表面蛋白的标记，避免标记细胞内蛋白。
缺点：
- 成本通常略高于普通NHS酯。
应用场景：细胞表面蛋白的生物素化标记、以及任何需要避免使用有机溶剂且要求标记均一性的实验。

此法并非直接使用预活化的生物素，而是提供一种“一步法”的偶联策略。

反应原理：此反应涉及三步：
1. EDC与带羧基的分子（如生物素）反应，生成一个不稳定的中间体O-酰基异脲。
2. 该中间体与伯氨基反应，形成酰胺键，并释放EDC的脲衍生物。
3. 为了防止中间体水解、提高偶联效率，常加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）或磺基-NHS，生成更稳定的NHS酯中间体（即又回到了方法一或二）。
优点：
- 灵活性强：无需预先购买活化好的生物素试剂，只需有普通的生物素（带羧基）和EDC/NHS即可进行标记。
缺点：
- 步骤繁琐：需要自行优化反应条件。
- 副反应多：EDC本身不稳定，易水解，效率通常低于预活化的NHS酯，且可能产生副产物。
- 纯化复杂：EDC的副产物需要通过透析或色谱法去除，较为麻烦。
应用场景：通常作为NHS酯法的补充，当需要将生物素连接到某些不含氨基但含羧基的分子上时，可以反向使用（将靶分子的羧基与生物素上的氨基偶联）。直接用于氨基标记的情况现已较少。

这是一种间接标记法，主要用于对糖蛋白或氧化后的羟基进行标记。

反应原理：
1. 预处理（氧化）：使用高碘酸钠（NaIO₄）氧化糖蛋白上的顺式二醇，生成醛基（-CHO）。
2. 标记反应：生物素酰肼上的肼基（-NH-NH₂）与生成的醛基发生亲核加成反应，形成腙键（-C=N-NH-），从而实现生物素标记。
3. 虽然目标是糖链，但该策略的起点是通过氧化生成醛基，而醛基也可以通过与氨基的还原胺化反应间接相关，因此也被视为一种与氨基相关的标记策略（尤其是在某些特定设计下）。
优点：
- 位点特异性：能够特异性地标记糖基化位点，避免影响蛋白质的活性区域。
缺点：
- 步骤多：需要先氧化，再标记。
- 腙键稳定性：形成的腙键不如酰胺键稳定，在酸性条件下可能水解。
应用场景：特异性标记糖蛋白（如抗体、膜受体），用于研究蛋白质的糖基化或富集糖蛋白。

如何选择？

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