非生物素法检测系统有哪些

非生物素检测系统全解析：原理、优势与应用指南

在免疫组化、免疫荧光和分子病理学诊断中，检测系统是信号放大和呈现的关键环节。长期以来，基于生物素-亲和素的ABC或LSAB法因其高灵敏度而被广泛应用。然而，生物素系统固有的问题催生了更优的解决方案——非生物素检测系统。本文将深入探讨什么是非生物素检测系统，其种类、优势，并指导您如何根据实验需求进行选择。

一、 什么是非生物素检测系统？为何需要它？

非生物素检测系统，顾名思义，是指在免疫检测过程中完全避免使用生物素和链霉亲和素/亲和素的信号放大系统。

用户之所以寻找它，主要是为了克服传统生物素系统的以下几大痛点：

1. 内源性生物素干扰：许多组织（如肝脏、肾脏、乳腺、脂肪等）本身含有内源性生物素。在使用生物素系统时，即使没有一抗，也会产生背景着色，导致假阳性结果，尤其在进行弱表达靶点检测时干扰巨大。
2. 实验步骤繁琐：传统的生物素系统通常需要多个孵育步骤（一抗、生物素化二抗、酶标亲和素/链霉亲和素），流程长，优化复杂。
3. 可能的非特异性结合：亲和素是糖蛋白，其糖链可能与组织中的凝集素等成分发生非特异性结合，增加背景。
4. 与生物素化药物或饮食的冲突：某些患者可能因治疗（如使用生物素化靶向药物）或服用高剂量生物素补充剂，导致体内生物素水平异常升高，干扰基于生物素的检测结果。

因此，非生物素系统应运而生，旨在提供更纯净的背景、更简化的流程和更可靠的结果。

二、 主要的非生物素检测系统有哪些？

目前主流的非生物素检测系统主要基于以下两类原理：

1. 聚合物/酶标聚合物系统

这是目前最常用、最成熟的非生物素检测技术。

• 核心原理：将大量的二抗分子和酶（如HRP或AP）直接偶联在一个惰性的、高分子的聚合物链上（如葡聚糖或多肽链）。这个“二抗-聚合物-酶”的复合物一步到位地完成了信号识别和放大。
• 工作流程：
  • 样本与一抗孵育。
  • 清洗后，直接加入聚合物-HRP/AP二抗。
  • 显色。
• 代表品牌/名称：
  • EnVision/EnVision+ 系统
  • Powervision
  • ImmPRESS
  • UltraVision
• 优势：
  • 无内源性生物素干扰：从根本上解决了最大的问题。
  • 高灵敏度与信噪比：单个聚合物上偶联了大量酶分子，信号放大效率高，背景干净。
  • 快速简便：通常只需两步（一抗和二抗），缩短实验时间。
  • 适用性广：可用于石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片等。

2. 酪胺信号放大系统

TSA是一种超灵敏的信号放大技术，它本身不依赖于生物素，但可以与非生物素系统联用，达到极致灵敏度。

• 核心原理：HRP催化标记有荧光基团或生物素的酪胺底物，在靶点位置产生高活性的酪胺自由基，后者能共价结合在邻近蛋白质的酪氨酸残基上，实现信号的原位沉积和几何级数放大。
• 重要提示：TSA系统本身可以是非生物素的（使用荧光素直接标记的酪胺），但早期的TSA试剂盒也可能使用生物素化酪胺。因此，在购买时需要明确选择非生物素版本的TSA试剂盒。
• 优势：
  • 极高的灵敏度：可将信号放大10-100倍，适用于检测极低丰度的靶点。
  • 多重检测能力：通过使用不同荧光标记的酪胺，可以在同一张切片上进行多靶标检测。
• 劣势：
  • 优化更复杂，需要精确控制孵育时间。
  • 信号扩散风险，需要优化至最佳状态。

3. 其他新型非生物素系统

随着技术发展，还出现了一些基于纳米材料或新型化学机制的检测系统，例如：

• 纳米金/银增强系统：利用金纳米颗粒标记二抗，再通过银染进行信号放大，主要用于电镜或无需显色剂的显色检测。
• DNA/RNA介导的信号放大：利用寡核苷酸链代替生物素作为标签，通过滚环放大或杂交链式反应实现信号放大，灵敏度极高，多用于原位杂交或超多重检测。

三、 如何选择适合的非生物素检测系统？

面对不同的选择，您可以参考以下指南：

• 对于常规免疫组化：

  • 首选聚合物系统。如EnVision、ImmPRESS等。它们在灵敏度、速度和背景控制方面取得了最佳平衡，是替代生物素系统的理想选择，适用于绝大多数诊断和科研需求。

• 对于超高灵敏度或弱表达靶点：

  • 考虑聚合物系统与TSA联用。先使用聚合物-HRP二抗，再使用非生物素的TSA荧光试剂进行放大。这能提供无与伦比的灵敏度。

• 对于多重荧光染色：

  • 方案一：使用来自不同宿主的、种属交叉吸附过的聚合物二抗（直接标记荧光染料）。
  • 方案二：采用非生物素的TSA系统进行轮次染色，这是实现多重染色的金标准方法。

• 对于内源性生物素丰富的组织：

  • 必须选择非生物素系统。无论是聚合物还是非生物素TSA，都能彻底避免此问题，确保结果的准确性。

四、 实验技巧与注意事项

1. 一抗优化：更换检测系统后，建议重新进行一抗的滴度或浓度优化，因为新系统的灵敏度和背景可能与旧系统不同。
2. 封闭：虽然避免了内源性生物素，但内源性过氧化物酶（对于HRP系统）或碱性磷酸酶（对于AP系统）仍需按常规方法进行封闭。
3. 二抗孵育：聚合物二抗的分子量较大，渗透性可能稍差，对于较厚的切片或需要深层抗原的检测，可适当延长孵育时间。
4. 试剂兼容性：确保您选择的非生物素系统与您的样本类型、一抗种属和显色底物相匹配。

总结