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在免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)的世界里,信号放大系统是决定实验成败的关键。长期以来,基于生物素-亲和素的ABC或LSAB法占据主导地位。然而,随着技术发展,非生物素法(如HRP聚合物或AP聚合物系统)正日益受到青睐。那么,非生物素法究竟有何优势?它为何能成为许多实验室的优选方案?本文将为您全面解析。
简单来说,非生物素法是一种不依赖生物素和链霉亲和素/亲和素结合的信号放大技术。
这种结构上的根本差异,奠定了其诸多优势的基础。
与传统的生物素法相比,非生物素法主要在以下几个方面展现出显著优势:
1. 彻底消除内源生物素干扰
这是非生物素法最突出、最直接的优势。在肝脏、肾脏、乳腺、甲状腺等许多组织中,本身就含有丰富的内源生物素。使用生物素法时,这些内源生物素会非特异性地与后续加入的链霉亲和素结合,导致高背景染色、假阳性结果,严重影响判读的准确性。非生物素法完全绕开了生物素系统,从根本上解决了这一棘手问题,使结果更加特异和可靠。
2. 更高的灵敏度与信噪比
非生物素法的聚合物载体上可以搭载数十个甚至上百个酶分子(如HRP),而生物素法每个二抗只能结合几个酶标记的亲和素分子。这意味着每个一抗位点能招募的酶分子数量大大增加,从而显著增强了信号强度。这种“一步法”的放大效率更高,不仅使得弱表达靶点的检测成为可能,也允许在保证信号强度的前提下,降低一抗的使用浓度,节省成本并进一步提高特异性。
3. 实验流程更简洁、快速
生物素法通常需要三步孵育(一抗→生物素二抗→酶标亲和素),而非生物素法仅需两步(一抗→酶标聚合物二抗)。减少一个步骤意味着:
4. 更低的背景染色
除了消除内源生物素干扰外,非生物素法通常背景更干净。因为聚合物系统经过精心设计和纯化,其非特异性结合远低于生物素-亲和素系统。亲和素是碱性蛋白(pI ~10.5),容易与带负电荷的组织成分发生静电吸附,从而增加背景。而非生物素聚合物试剂则避免了这一问题。
5. 卓越的批次间稳定性
生物素-亲和素的结合效率可能因批次不同而略有差异,影响实验的重复性。而非生物素法的酶标聚合物二抗是高度标准化的产品,批次间一致性更好,确保了实验结果的稳定性和可重复性,这对于长期研究和临床诊断至关重要。
6. 出色的多重染色兼容性
在进行多重IHC/IF实验时,如果需要使用不同种属来源的一抗,生物素系统会变得复杂。例如,如果两个一抗都是小鼠来源,那么生物素系统将难以区分。而非生物素法可以直接提供不同酶标(如HRP和AP)或不同荧光素标记的聚合物二抗,更容易进行方案设计和优化,避免交叉反应。
综合其优势,非生物素法特别适用于以下情况:
尽管非生物素法优势明显,但生物素法技术成熟、成本低廉,在某些不含内源生物素干扰的常规检测中依然可靠。选择时可以考虑: