怎么给核酸加生物素

如何给核酸（DNA/RNA）加生物素：方法与策略全解析

在分子生物学、基因检测、诊断技术（如原位杂交、Southern/Northern blot）以及前沿的测序技术（如单分子测序）中，将核酸（DNA或RNA）与生物素（Biotin）共价结合是一项非常关键的技术。生物素-亲和素（Biotin-Avidin/Streptavidin）系统因其近乎不可逆的高亲和力结合，成为捕获、富集和检测靶分子最强大的工具之一。

那么，如何高效、特异地将生物素分子“安装”到核酸链上呢？本文将系统性地介绍主流方法，帮助您根据实验目的选择最合适的策略。

一、 核心方法概览

给核酸加生物素主要分为两大类：化学合成法 和 酶学法。选择取决于您的起始材料（是合成的寡核苷酸还是长的DNA/RNA片段）、所需的标记位置（末端还是内部）以及标记密度。

二、 化学合成法

这种方法主要在自动化DNA合成仪上完成，适用于制备生物素标记的寡核苷酸探针或引物。

原理： 在合成DNA链的过程中，使用带有生物素修饰的亚磷酰胺单体（Biotin-phosphoramidite）在特定位点引入生物素。生物素通过一个长长的 spacer（如C6或PEG间隔臂）与核苷酸相连，这个间隔臂至关重要，它能减少生物素与核酸骨架之间的空间位阻，确保其能与亲和素高效结合。

标记位置：

1. 5’ 末端标记：最常见的方式。在合成的最后一步，使用生物素修饰的CPG（固相载体）或特殊的生物素亚磷酰胺试剂，将生物素直接加在链的5’末端。适用于作为捕获探针或PCR引物。
2. 3’ 末端标记：较少见，通常通过特殊的可控孔玻璃（CPG）载体实现。
3. 内部标记：在合成过程中，在任何 desired 的位置（如某个特定的A、T、C、G碱基上）插入生物素修饰的核苷酸单体。适用于需要高密度标记或特定内部位点标记的探针。

优点：

• 标记位置精确：可以精确控制生物素的数量和位置。
• 标记率高：通常接近100%，非常高效。
• 方便快捷：可直接向合成公司订购，无需自己后续处理。

缺点：

• 仅适用于化学合成的短链寡核苷酸（通常<100 nt），无法直接标记长的PCR产物或基因组DNA。

三、 酶学法

酶学方法适用于对较长的、通过酶促反应生成的核酸片段（如PCR产物、体外转录的RNA等）进行标记。

1. 缺口平移法（Nick Translation）

• 原理： 利用DNase I在双链DNA上随机制造缺口，再利用DNA Polymerase I的5’→3’外切酶活性和聚合酶活性，在修复缺口的过程中掺入生物素标记的核苷酸（如Biotin-dUTP）。
• 特点： 可生成高密度、均匀标记的长链DNA探针，适用于Southern blot等高灵敏度检测。

2. 随机引物标记法（Random Primering）

• 原理： 使用随机序列的六聚体引物与变性的单链DNA模板结合，在DNA聚合酶（如Klenow片段）的催化下，以生物素标记的核苷酸（Biotin-dUTP/dCTP）为底物，合成带有生物素标记的新DNA链。
• 特点： 比缺口平移法更高效，产生的探针比活性更高，同样适用于制备高灵敏度的检测探针。

3. PCR标记法

• 原理： 在最常见的PCR反应中，将生物素标记的dNTP（通常是Biotin-dUTP）的一部分替代正常的dTTP，或者直接使用5’端生物素标记的引物。
  * 掺入标记： 使用Biotin-dUTP，PCR产物会全程、随机地标记上生物素，整条链都可被亲和素捕获。
  * 末端标记： 使用5‘生物素标记的引物，PCR产物的一条链或两条链的5’末端会带有生物素标记（取决于是一条还是两条引物被标记）。这种方法在NGS建库中用于捕获链特异性片段非常普遍。
• 特点： 灵活性强，既可实现全长标记，也可实现特异性末端标记。

4. 末端标记法（Tailing）

• 原理： 使用末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在DNA的3’末端添加一个同聚物尾巴，在反应中加入Biotin-dUTP/ddUTP，即可将生物素加到3’末端。
• 特点： 每个DNA分子通常只添加一个生物素分子，适用于不需要高密度标记的末端捕获实验。

5. 体外转录法（用于RNA标记）

• 原理： 如果克隆的DNA模板上游有噬菌体启动子（如T7, SP6, T3），可以使用相应的RNA聚合酶进行体外转录，并在反应中加入生物素标记的UTP（Biotin-UTP）或CTP，从而合成生物素标记的RNA探针。
• 特点： 是制备生物素标记RNA探针的最佳方法，标记效率高，产量大。

四、 如何选择方法？决策指南

五、 注意事项与常见问题

1. 间隔臂（Spacer）：无论是化学合成还是酶法使用的底物，生物素和核苷酸之间必须有一个足够长的间隔臂（如C6, C12, PEG）。这能极大提高其与链霉亲和素结合的可及性（accessibility）和效率。
2. 纯化：标记反应后，必须去除未掺入的生物素标记核苷酸或短片段，否则他们会竞争性地与亲和素结合，严重干扰后续实验。常用的纯化方法有：乙醇沉淀、凝胶过滤（如G-50柱子）、磁珠纯化等。
3. 检测标记效率：可以通过点杂交（Dot Blot）来快速检测标记是否成功：将标记产物系列稀释点在膜上，用链霉亲和素-HRP/AP孵育后进行显色，与已知浓度的标准品对比即可估算标记效率。
4. 稳定性：生物素标记的核酸在-20°C下可长期稳定保存，应避免反复冻融。