地高辛和生物素标记的使用方法

作者：小编更新时间：2025-09-30

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在分子生物学和细胞生物学研究领域，非放射性标记技术已成为不可或缺的工具。其中，地高辛和生物素标记系统因其高灵敏度和安全性，被广泛应用于核酸（DNA、RNA）和蛋白质的检测中。本文将深入解析这两种标记技术的使用方法、优缺点、应用场景及关键技巧，助您完美设计实验。

1. 地高辛标记系统

原理：地高辛是一种来源于植物的甾体半抗原，在动物组织中不存在。因此，使用地高辛标记的探针进行实验时，不会与样本内源性物质发生交叉反应，背景极低。
工作方式：先将地高辛通过化学方法标记到探针（核酸或蛋白）上。然后，使用偶联了酶（如碱性磷酸酶AP或辣根过氧化物酶HRP）的抗地高辛抗体与地高辛特异性结合。最后，加入酶的底物（生色或化学发光底物）产生可检测的信号。

2. 生物素标记系统

原理：生物素是一种水溶性维生素（维生素B7），广泛存在于生物体中。它与亲和素/链霉亲和素具有极高的亲和力（Kd ≈ 10^-15 M），是自然界中最强的非共价相互作用之一。
工作方式：先将生物素标记到探针上。然后，使用偶联了酶的链霉亲和素/亲和素与生物素结合。最后，通过底物显色或发光来检测信号。

两种标记系统的实验流程大同小异，主要区别在于检测试剂。

通用流程：

探针标记
- 地高辛标记：常用随机引物法或体外转录法。在反应体系中加入地高辛标记的dUTP（用于DNA）或UTP（用于RNA），通过聚合酶合成掺入地高辛的探针。
- 生物素标记：方法与地高辛类似，使用生物素标记的dUTP。此外，也可以通过光敏生物素进行化学标记。
杂交
- 将标记好的探针与经过预处理的样本（如细胞、组织切片或膜上的核酸）进行杂交。探针会与互补的目标序列特异性结合。
洗脱
- 通过一系列不同严格度的缓冲液洗去未特异性结合的探针，降低背景。
封闭
- 用封闭剂（如BSA、脱脂奶粉）处理样本，封闭非特异性结合位点，这对于降低背景至关重要。
检测与显色
- 地高辛系统：加入抗地高辛抗体-酶（AP/HRP）偶联物，孵育后洗去未结合的抗体。
- 生物素系统：加入链霉亲和素-酶（AP/HRP）偶联物，孵育后洗去未结合的链霉亲和素。
- 最后一步：加入相应的底物。
  - 生色底物（如NBT/BCIP for AP， DAB for HRP）：产生不溶性的有色沉淀，可在光学显微镜下直接观察。
  - 化学发光底物（如CDP-Star for AP， Luminol for HRP）：产生光信号，通过X光胶片或化学发光成像系统捕获，用于定量或高灵敏度检测。

特性	地高辛系统	生物素系统
背景	极低。因内源性物质中无地高辛，特异性高。	可能较高。生物素广泛存在于哺乳动物组织（如肝、肾），易产生内源性背景。
灵敏度	非常高。尤其与碱性磷酸酶和化学发光底物联用时，灵敏度可达放射性标记水平。	高。但可能略逊于优化后的地高辛系统。
特异性	非常高，信噪比优异。	高，但需注意内源性生物素的干扰。
成本	相对较高（抗体成本）。	相对较低（链霉亲和素成本较低）。
主要应用	原位杂交、Northern/Southern blot、菌落杂交等对背景要求高的实验。	ELISA、Western blot、免疫组化、蛋白pull-down等。
注意事项	需确保抗地高辛抗体的质量。	实验前常需用封闭液阻断内源性生物素和亲和素结合位点。

选择建议：

如何降低背景？
- 地高辛：优化探针浓度和洗脱严格度，确保封闭彻底。
- 生物素：使用商品化的内源性生物素封闭试剂盒，或在实验前用过量游离亲和素和生物素进行预处理。
信号弱或无信号怎么办？
- 检查探针：探针标记效率是否足够？可通过标记对照进行测试。
- 检查试剂活性：酶偶联物和底物是否新鲜有效？是否在有效期内？
- 优化实验条件：延长抗体/链霉亲和素孵育时间，或提高其浓度。确保底物孵育时间充足。
如何提高灵敏度？
- 使用酪酰胺信号放大技术。该技术能与地高辛和生物素系统完美结合，将信号放大数百甚至上千倍，用于检测极低丰度的靶标。
生色还是化学发光？
- 生色法：优点是可肉眼观察、结果永久保存、定位精确，适用于原位杂交的显微镜观察。缺点是灵敏度相对较低。
- 化学发光法：优点是灵敏度极高、可定量、适用于膜杂交（Northern/Southern/Western blot）。缺点是信号会衰减，需要成像系统。

总结

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