生物素影响流式吗

生物素会影响流式结果吗？一文为您全面解析与解决方案

在进行流式细胞术实验时，任何一个微小的细节都可能对结果产生重大影响。许多研究者，尤其是在进行免疫学研究或使用某些商品化试剂盒时，都会遇到一个共同的问题：生物素是否会影响我的流式数据？

答案是：会的，而且影响可能非常显著。 如果您忽略了这一点，很可能导致实验结果出现假阴性、背景升高甚至完全错误的结论。本文将深入探讨生物素如何影响流式检测，并提供一套完整的解决方案。

一、 核心原理：为什么生物素会干扰流式实验？

要理解这个问题，我们首先要了解流式细胞术中一种非常普遍的检测系统——生物素-链霉亲和素系统。

1. 强大的结合能力：生物素（维生素B7）与链霉亲和素（或普通亲和素）之间具有极高的亲和力（Kd ≈ 10^-15 M），这种结合力比大多数抗原-抗体反应还要强百万倍。因此，该系统被广泛用于信号放大，提高检测的灵敏度。
2. 常见应用场景：
   • 多色 panel 中的二抗：在涉及多个标记物的实验中，研究者可能会使用生物素化的初级抗体，然后再用偶联了荧光染料的链霉亲和素进行检测。
   • 预偶联的抗体：许多商品化的流式抗体，本身就使用了生物素-链霉亲和素系统进行信号放大。
   • 检测试剂：某些细胞因子检测、增殖检测的试剂中也含有生物素组分。

干扰的产生：当实验动物或细胞培养体系中存在外源性的高剂量生物素时，这些游离的生物素会抢先与流式试剂中的链霉亲和素结合。这会导致：

• 信号阻断：荧光染料无法通过链霉亲和素连接到目标抗体上，导致目标蛋白的信号显著减弱甚至消失（假阴性）。
• 背景升高：非特异性结合也可能发生，导致信噪比下降。

二、 生物素的主要来源：您的干扰从何而来？

了解来源是解决问题的第一步。生物素的干扰主要来自以下几个方面：

1. 动物饲料与饮用水：

   • 这是最常见且最容易忽视的来源。许多商业啮齿动物饲料中会添加高剂量的生物素，以促进动物生长和保持皮毛健康。这些生物素会在实验动物（如小鼠、大鼠）的血清和组织中积累，达到足以干扰实验的浓度。

2. 细胞培养体系：

   • 标准的细胞培养血清（如胎牛血清 FBS）中含有一定量的生物素。虽然在常规培养中浓度通常不足以造成干扰，但在使用特殊培养基或长时间培养时，可能需要考虑其影响。

3. 实验性补充：

   • 在某些代谢、基因表达或疾病模型研究中，研究人员会故意给动物或细胞添加高剂量的生物素，这无疑会带来严重的干扰。

4. 人体样本：

   • 对于临床流式检测（如检测人外周血样本），如果受试者正在服用高剂量的生物素补剂（常用于改善头发、皮肤和指甲），其血浆中的生物素浓度可能异常升高，从而影响以生物素-链霉亲和素系统为基础的诊断性流式检测，导致错误的临床解读。

三、 如何判断与解决生物素干扰问题？

如果您怀疑自己的流式结果受到了生物素的影响，可以遵循以下流程进行排查和解决：

第一步：判断是否存在干扰

• 典型症状：
  • 信号减弱或丢失：原本预期表达阳性的细胞群，其荧光信号强度远低于预期或完全检测不到。
  • 实验组与对照组差异异常：特别是当实验组涉及生物素处理时，与对照组相比，信号差异不符合生物学常识。
  • 仅在使用SAV荧光染料时出现问题：其他直接偶联抗体的通道信号正常，唯独依赖于生物素-链霉亲和素的通道信号异常。

第二步：解决方案与优化策略

1. 从源头控制——更换饲料（针对动物实验）

   • 最佳方案：在实验开始前（建议至少提前1-2周），将实验动物更换为 “无生物素”或“低生物素”的特制饲料。这是最根本、最有效的解决方法。
   • 注意事项：更换饲料可能需要动物房的配合，并需要一个适应期。

2. 优化实验设计——避开生物素系统

   • 重新设计抗体 Panel：在构建多色流式Panel时，优先选择直接偶联荧光染料的抗体，避免使用需要生物素-链霉亲和素放大的间接检测方法。
   • 咨询供应商：在购买抗体时，查看其说明书，确认其是否使用了生物素系统。

3. 样本前处理——洗涤与封闭

   • 充分洗涤：在染色前，对细胞（尤其是从高生物素环境中取出的细胞）进行多次、彻底的洗涤，可以去除一部分游离的生物素。
   • 使用链霉亲和素进行封闭：这是一种有效的补救措施。
     • 操作流程：在加入生物素化的抗体之前，先向细胞中加入过量、未标记的链霉亲和素，孵育15-20分钟。这些“游离”的链霉亲和素会与细胞内外源性的生物素结合。然后，无需洗涤，直接加入您的生物素化抗体和后续的SAV荧光染料。此时，荧光SAV会与刚刚加入的生物素化抗体结合，而不会被样本中的游离生物素阻断。
     • 优点：此法能有效挽救因生物素干扰而失败的实验。

4. 针对临床样本的警示

   • 对于临床流式实验室，应建立标准操作程序，询问患者是否在采样前服用高剂量生物素补剂，并在报告中进行备注，以避免误诊。

四、 实用技巧速查表

总结

生物素确实会显著影响流式细胞术的结果，其主要通过竞争性结合来阻断基于链霉亲和素的检测信号。通过识别其来源（动物饲料、细胞培养、人为补充），并采取针对性的预防和解决措施（更换饲料、优化Panel、使用封闭法），您可以有效地避免这一“隐形杀手”对您宝贵实验数据的破坏。