蛋白质巯基的生物素化是生物化学和分子生物学研究中一项重要的标记技术，广泛应用于蛋白质检测、纯化和功能研究领域。本文将全面解析这一技术的原理、应用和实验方案，为研究者提供实用的参考资料。
蛋白质中的巯基（-SH）主要存在于半胱氨酸残基的侧链上，具有独特的亲核性和还原性。与其他氨基酸侧链相比，巯基具有更高的化学反应活性，特别是在还原环境下，能够与多种功能性基团发生特异性反应。
用于巯基生物素化的试剂主要分为两类：
马来酰亚胺类生物素试剂：
这类试剂含有马来酰亚胺基团，能与巯基发生高效的迈克尔加成反应，形成稳定的硫醚键。常见的包括生物素-BMCC、生物素-PEG2-马来酰亚胺等。它们对巯基具有高度选择性，在中性至弱碱性pH条件下反应效果最佳。
碘乙酰基类生物素试剂：
如生物素碘乙酰胺，这类试剂通过烷基化反应与巯基结合，形成稳定的硫醚键。它们在较宽的pH范围内都能保持反应性，但特异性略低于马来酰亚胺类试剂。
还原性巯基的暴露：
对于含有二硫键的蛋白质，需要先用还原剂（如TCEP或DTT）处理，将氧化的巯基还原为活性形式。通常使用5-20 mM TCEP在室温下处理30分钟。
去除多余还原剂：
反应前必须通过脱盐柱或透析去除还原剂，防止其与生物素化试剂竞争反应。
反应缓冲液：
试剂比例与浓度：
反应时间与温度：
反应完成后，加入过量半胱氨酸或β-巯基乙醇终止反应。通过凝胶过滤或透析去除未反应的生物素化试剂。
