蛋白质偶联生物素是生物化学和分子生物学研究中一项重要的实验技术，广泛应用于检测、分离和纯化等多种实验场景。本文将全面解析这一技术的核心原理、操作方法及应用领域。
生物素-亲和素系统是自然界中最强大的非共价相互作用之一，具有极高的亲和力（Ka≈10^15 M^-1）。这种强大的结合能力使得生物素化蛋白质在实验中能够被高效、特异地捕获或检测。
生物素，又称维生素H，是一种小分子水溶性维生素（分子量244.31 Da），能够与蛋白质中的特定官能团共价结合。由于其分子量小，偶联到蛋白质上后通常不会显著改变蛋白质的结构和功能。
蛋白质偶联生物素主要通过以下化学反应实现：
NHS酯法：
这是最常用的生物素化方法，适合含有赖氨酸残基的蛋白质。反应在pH 7.2-8.5的缓冲液中进行，避免含有氨基的缓冲液（如Tris、甘氨酸）。优点是反应效率高、条件温和；缺点是可能影响蛋白质的活性位点。
马来酰亚胺法：
专门用于含有游离半胱氨酸的蛋白质。反应在pH 6.5-7.5的缓冲液中进行，避免含有巯基的还原剂（如DTT、β-巯基乙醇）。优点是位点特异性高；缺点是蛋白质必须含有可及的巯基。
生物素连接酶法：
利用生物素连接酶（如BirA）将生物素特异性地连接到特定的氨基酸序列（如AviTag）上。这种方法具有极高的特异性，可实现位点特异性标记，且标记程度均一。缺点是需要在蛋白质中引入特定的标签序列。
蛋白质预处理：
生物素试剂准备：
偶联反应：
