怎样活化生物素菌株

生物素菌株活化全攻略：从冻存管到高产菌液

在微生物发酵、生物制药及科研实验中，生物素菌株（通常指依赖生物素作为生长因子或用于生产生物素的菌株，如Bacillus subtilis, E. coli 工程菌等）的活化是成功的第一步。活化失败，后续的所有实验和生产都将无从谈起。本文将为您详细解析生物素菌株活化的标准流程、关键要点和常见问题解决方案，帮助您轻松恢复菌株活力。

一、 为什么需要活化？理解活化的本质

您从菌种保藏中心、合作实验室或自家-80°C冰箱中取出的菌株，通常是以甘油冻存管或穿刺 stab 的形式保存的。这些菌株处于代谢活动极低甚至停止的休眠状态（如孢子或稳定期细胞）。

“活化”的本质就是：

1. 恢复活性：为这些“沉睡”的菌株提供最适宜的营养、温度和环境，唤醒它们，使其恢复正常的生长和代谢能力。
2. 扩增数量：将少量的保存菌种，通过逐级放大培养，获得数量充足、活性旺盛的种子液，用于后续的发酵或实验。
3. 确保纯度：在活化过程中检查菌落形态，避免杂菌污染，保证后续实验结果的可靠性。

对于“生物素菌株”而言，活化过程需要特别留意生物素的补充，因为它是该类菌株生长所必需的生长因子。

二、 标准活化操作步骤（以甘油冷冻管为例）

准备工作：

• 无菌环境：超净工作台或酒精灯火焰旁操作。
• 培养基：准备适宜的液体培养基（如LB培养基）和固体琼脂平板。关键点：根据菌株特性，在培养基中额外添加适量过滤除菌的生物素溶液（通常终浓度为0.1-1 mg/L）。 确认培养基中不含任何抑制剂。
• 工具：无菌接种环、无菌吸头、移液器、无菌试管/三角瓶。
• 设备：恒温摇床、恒温培养箱。

活化流程：

1. 解冻与复苏：

   • 从-80°C冰箱或液氮中快速取出甘油菌种管（避免反复冻融）。
   • 置于冰上或室温下进行部分解冻（约融化一半即可），或用掌心快速捂热。此步骤旨在减少低温对细胞的损伤。

2. 划线分离（第一代活化）：

   • 用无菌接种环蘸取少量菌液（或直接蘸取未完全融化的冰晶）。
   • 在含有生物素的固体琼脂平板上进行划线，目的是分离出单个菌落，并检验纯度。
   • 将平板倒置放入恒温培养箱中（温度根据菌株手册设定，如30°C或37°C），培养12-24小时。

3. 挑取单菌落与扩培（第二代活化）：

   • 培养后，平板上应长出单个、形态一致的菌落。
   • 用无菌接种环挑取一个饱满、形态典型的单菌落。
   • 接种到含有3-5mL液体培养基（务必加生物素）的试管中。
   • 将试管置于恒温摇床中，以适当的转速（如200-250 rpm）振荡培养6-12小时，直至培养基变浑浊。

4. 扩大培养（第三代活化 - 制备种子液）：

   • 按1%-2% 的接种量，将上一步的菌液转接到体积更大的液体培养基中（如50mL培养基/250mL三角瓶）。
   • 同样条件下继续振荡培养，直到菌液达到对数生长后期（OD600值通常为2-4，具体因菌而异），此时菌群活性最强，适合作为种子液接入发酵罐或用于下一步实验。

三、 关键注意事项与常见问题解答（Q&A）

Q1: 活化后菌株不长或生长缓慢，可能是什么原因？

• 生物素缺失或不足：这是最常见的原因。检查培养基中是否已添加足量且有效的生物素。生物素极易被光、氧化剂等破坏，建议配制后避光保存，并过滤除菌而非高温灭菌。
• 活化次数不足：休眠深度的菌株（尤其是孢子）可能需要连续活化2-3代才能完全恢复活性。请耐心重复步骤2和3。
• 培养基或温度不匹配：确认使用的培养基和培养温度完全符合该菌株的生物学特性。
• 菌种已失活：如果保存不当（如反复冻融、冰箱温度不稳定），菌种可能已死亡。需重新获取菌种。

Q2: 如何判断活化是否成功？

• 固体平板：长出形态一致、湿润、光滑的单一类型菌落。
• 液体培养：培养后液体变浑浊，OD600值显著上升。
• 镜检：取菌液涂片染色，在显微镜下观察，细胞形态应正常、排列整齐、无杂菌。

Q3: 活化过程中发现污染了怎么办？
立即丢弃！对所有涉及的培养基、平板、工具进行严格灭菌处理。重新从头开始操作，并更加注意无菌规范。如果污染频繁发生，需检查超净工作台的洁净度、操作人员的无菌技术以及培养基的灭菌效果。

Q4: 活化后的菌株可以保存多久？

• 短期保存：新活化的菌株在固体平板上（封口膜封好）4°C冰箱可保存1-2个月。
• 中长期保存：最好制备成甘油管（菌液与无菌甘油按终浓度15%-25%混合），置于**-80°C**冰箱中，可保存数年。这是最可靠的保存方法。

Q5: 如果是孢子菌株，活化有什么不同？
对于芽孢杆菌等产孢子菌株，活化前有时需要进行热激处理以刺激孢子萌发：将冻存管或菌液在65-80°C水浴中加热10-30分钟，再迅速冷却，然后进行划线或接种。这一步能有效杀死营养细胞并激活孢子。

四、 活化后的应用

成功活化的菌株（种子液）可以立即用于：

• 接种至发酵罐进行大规模发酵，生产目标产物（如酶、抗生素、生物素本身）。
• 提取质粒或基因组DNA。
• 进行各种生理生化实验研究。