蛋白加生物素（生物素标记）是生物化学和分子生物学研究中一项重要的实验技术，它利用生物素与亲和素之间极强的亲和力，实现对特定蛋白的检测、纯化和追踪。本文将全面介绍蛋白加生物素的原理、操作方法、应用场景及常见问题解决方案。
生物素，又称维生素B7或维生素H，是一种水溶性小分子维生素。其与亲和素或链霉亲和素的结合具有极高亲和力（Kd≈10^-15 M），比大多数抗原-抗体反应的亲和力高出数个数量级。这种特性使生物素-亲和素系统成为生物检测和纯化的理想工具。
蛋白加生物素的原理是通过化学或酶学方法将生物素分子共价连接到目标蛋白上，形成生物素标记的蛋白。这些标记的蛋白可以与连接有亲和素或链霉亲和素的各类载体结合，如磁珠、琼脂糖珠或检测系统（如ELISA、Western blot）等。
氨基定向标记：
最常见的生物素标记方法，使用NHS酯类生物素试剂（如NHS-LC-Biotin）与蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基反应。这种方法简单高效，适用于大多数蛋白标记。
巯基定向标记：
针对含有半胱氨酸残基的蛋白质，使用马来酰亚胺类生物素试剂与巯基反应。这种方法特异性更高，适合对特定巯基进行标记。
羧基定向标记：
使用碳二亚胺化学法将生物素酰肼与蛋白质中的天冬氨酸和谷氨酸残基连接。
生物素连接酶法：
使用BirA酶在特定序列（如AviTag）上标记生物素，这种方法标记位点精确，特异性极高，适合需要定点标记的研究。
甲酰甘氨酸生成酶法：
利用FGE酶在特定序列（如AEPG-MRHKLA-短序列）上产生甲酰甘氨酸，然后与生物素衍生物反应。
利用生物素标记的蛋白作为“诱饵”，与链霉亲和素珠结合，从细胞裂解液中“钓取”相互作用的蛋白。
