蛋白发生自生物素化需要警惕的四种情况

好的，我们来撰写这篇文章。

蛋白发生自生物素化？需要警惕的这四种情况及解决方案

在Western Blot实验，尤其是使用链霉亲和素-生物素放大系统时，研究人员有时会观察到意料之外的条带或高背景。这其中一个常见“陷阱”就是蛋白的自生物素化。所谓自生物素化，是指实验样本中的蛋白在生物体内或实验过程中，非特异性地结合了生物素，从而在后续检测中被显色，导致结果误判。

如果您正在搜索这个问题，说明您很可能在实验中遇到了干扰，并希望找到问题的根源和解决方法。本文将深入剖析需要警惕的四种主要情况，并提供全面的解决方案。

情况一：内源性生物素的干扰

这是最常见也是最容易被忽略的情况。

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  根源分析：
             许多生物体自身就含有结合了生物素的蛋白质，我们称之为“内源性生物素化蛋白”。最典型的例子是羧化酶（如丙酮酸羧化酶、乙酰辅酶A羧化酶），它们在催化反应中需要生物素作为辅因子。这些蛋白在肝脏、肾脏、乳腺、脑组织等代谢活跃的组织和细胞中含量尤为丰富。因此，当使用这些组织的裂解液时，即使不进行任何外源性生物素标记，在Western Blot中也会出现强烈的信号。

• 如何识别与解决：

  1. 设置阴性对照： 在您的实验设计中，务必设置一个不加一抗的对照。如果在该对照中依然出现目标条带，则强烈暗示存在内源性生物素或二抗非特异性结合的干扰。
  2. 使用预吸附/高特异性二抗： 选择经过内源性生物素吸附处理的链霉亲和素-HRP，可以显著降低背景。
  3. 进行生物素封闭： 在转膜后，用游离的生物素或专业的生物素封闭试剂对膜进行孵育，饱和内源性生物素的结合位点。
  4. 更换检测系统： 如果干扰严重，最直接有效的方法是放弃链霉亲和素-生物素系统，改用直接偶联了HRP的二抗进行检测。

情况二：实验处理诱导的自生物素化

某些实验条件会主动诱导细胞发生广泛的蛋白生物素化。

• 根源分析：
             当细胞处于严重的氧化应激状态下（如用过氧化氢、药物或其他应激源处理），体内的活性氧会破坏线粒体功能，导致生物素羧化酶活性异常，进而可能引发非特异性的蛋白生物素化。这是一种细胞在应激下的病理生理现象。

• 如何识别与解决：

  1. 关联实验处理： 如果意外条带主要出现在经过特定处理的实验组，而对照组很干净，就需要怀疑是处理本身诱导的。
  2. 设立内部对照： 在实验设计中包含已知不表达目标蛋白的细胞或空载载体转染的细胞，以区分目标信号与非特异性自生物素化信号。
  3. 验证结果： 通过siRNA敲低或CRISPR敲除您的目标蛋白，如果意外条带依然存在，则基本可以确定是其他蛋白的自生物素化造成的。
  4. 考虑替代检测方法： 同样，换用非生物素系统的检测方法是最可靠的验证途径。

情况三：试剂或样品污染

这是一个源于实验操作的“人为”情况。

• 根源分析：
             实验过程中使用的胎牛血清 中含有丰富的生物素。如果在细胞培养或裂解液配制过程中不慎引入，或者实验器具、缓冲液被含有生物素的试剂污染，就可能导致样品中所有蛋白的非特异性生物素化。

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  如何识别与解决：

  1. 检查试剂来源： 回顾实验流程，确认所有与样品接触的试剂（尤其是血清）是否可能含有生物素。
  2. 保持操作洁净： 使用专用的器具和移液器处理生物素相关的试剂，避免交叉污染。
  3. 设立空白对照： 准备一个不含蛋白的裂解液样本（即只有裂解液缓冲液）作为对照，与样品一起进行电泳和显色。如果这个空白对照也出现信号，则证明存在试剂污染。
  4. 纯化蛋白样品： 通过丙酮或TCA沉淀法纯化蛋白，可以去除样品中游离的生物素和其他小分子污染物。

情况四：细胞培养基中高浓度生物素的影响