带生物素的流式抗体有哪些

全面解析：带生物素的流式抗体及其应用策略

在设计和进行高参数流式细胞术实验时，研究人员经常会接触到“带生物素的流式抗体”。这类抗体并非直接用于检测，而是作为一种灵活而强大的工具，在多色面板构建中扮演着关键角色。本文将深入探讨什么是带生物素的流式抗体、它们的核心优势、常见种类、标准实验步骤以及关键的注意事项，帮助您全面掌握其应用。

一、 什么是带生物素的流式抗体？

带生物素的流式抗体，顾名思义，是一种预先与生物素分子偶联的抗体。生物素，也称为维生素B7或维生素H，是一种小分子维生素。

它的工作原理基于生物素与链霉亲和素之间极其强大且特异的结合作用（这种结合是自然界中最强的非共价作用之一）。在流式实验中，带生物素的抗体首先与目标细胞抗原结合，随后通过添加荧光染料标记的链霉亲和素进行“二次”检测和信号放大。

简单来说，这个过程是：生物素化一抗 + 荧光标记链霉亲和素 = 可检测的信号。

二、 为什么需要使用它？核心优势与应用场景

用户搜索这个关键词，背后通常隐藏着以下几个核心需求点，而这也正是生物素化抗体的价值所在：

1. 构建高参数流式面板，节省荧光通道

   • 需求点：当流式细胞仪的激光器和滤光片数量有限时，如何检测更多的目标蛋白？
   • 解答：链霉亲和素可以与多种染料（如PE、APC、BV421等）偶联，并且市面上有大量预制的荧光链霉亲和素出售。研究人员可以购买同一种生物素化的一抗，然后根据不同的实验面板，搭配不同荧光染料的链霉亲和素。这使得一个生物素化抗体可以在多个实验中被灵活使用，无需购买多个不同荧光标记的直接偶联抗体，极大地节省了成本和荧光通道。

2. 信号放大，检测弱表达抗原

   • 需求点：当目标抗原表达量非常低时，直接偶联抗体的信号强度不够，导致结果不清晰。
   • 解答：一个链霉亲和素分子拥有四个生物素结合位点。这意味着它可以同时结合多个生物素分子。在反应中，多个荧光标记的链霉亲和素分子可以结合到同一个生物素化抗体上，从而将荧光信号显著放大，使得检测低丰度抗原成为可能。

3. 用于 tandem dye 的替代方案

   • 需求点：某些串联染料（如PE-Cy7）对光、固定等条件敏感，容易降解和解离，导致荧光渗漏。
   • 解答：使用生物素化抗体，然后搭配更稳定的荧光链霉亲和素（例如，选择更耐用的染料偶联的链霉亲和素），有时可以作为串联染料不稳定问题的一个有效解决方案。

4. 用于分选和特殊实验设计

   • 需求点：在进行细胞分选时，需要更纯净的分离。
   • 解答：生物素-链霉亲和素系统可用于阴性分选或复杂的分选策略。例如，通过使用生物素化抗体去除不需要的细胞群，或者进行多步的细胞富集。

三、 常见的带生物素的流式抗体有哪些？

实际上，几乎所有常见的流式抗体靶点都有对应的生物素化版本。它们主要可以分为以下几大类：

• 免疫细胞表面标志物抗体：这是最常用的一类。

  • 小鼠：如 anti-mouse CD3e, CD4, CD8a, CD19, CD11b, CD11c, NK-1.1, Ly-6G/Gr-1, F4/80等。
  • 人：如 anti-human CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56, CD45RA, CD45RO等。

• 细胞因子受体及其他功能蛋白抗体：

  • 如 anti-CD25 (IL-2R α), CD122 (IL-2R β), CD127 (IL-7R α), CD184 (CXCR4)等。

• 同种型对照：

  • 为了确保实验的特异性，同样存在生物素化的同型对照抗体（如Biotin Mouse IgG1, κ Isotype Control）。

如何查找：您可以在各大抗体生产商的官网（如BD Biosciences, BioLegend, Tonbo Biosciences, eBioscience, R&D Systems等），通过搜索目标蛋白名称，并在“Conjugate”或“Format”一栏中选择“Biotin”来找到特定的产品。

四、 标准实验流程简介

使用生物素化抗体进行流式染色的流程，仅比直接染色法多一步：

1. 样本制备：制备单细胞悬液。
2. Fc受体封闭：（可选但推荐）使用纯化的IgG或特异性封闭剂，减少非特异性结合。
3. 表面染色：
   • 将生物素化抗体与其他直接标记的荧光抗体同时加入样本中。
   • 孵育，避光。
4. 洗涤：用流式染色缓冲液洗涤细胞，去除未结合的抗体。
5. 链霉亲和素染色：
   • 加入适量、经过滴定确定的荧光染料标记的链霉亲和素。
   • 孵育，避光。
6. 洗涤：再次洗涤，去除未结合的链霉亲和素。
7. 上机检测：重悬细胞，在流式细胞仪上进行采集和分析。

注意：由于多了一步反应，务必设置正确的对照，特别是：

• 阴性对照：仅使用荧光链霉亲和素（不加生物素化一抗），以评估链霉亲和素与细胞的非特异性结合。
• 单染对照：用于补偿，需要使用含有该荧光染料的链霉亲和素单独染色的样本。

五、 关键注意事项与技巧

• 滴定至关重要：无论是生物素化抗体还是荧光链霉亲和素，都必须进行滴定实验，以找到信噪比最佳的使用浓度。过量使用会导致背景过高。
• 避免内源性生物素干扰：在某些细胞（如肝细胞、肾脏细胞、某些激活的免疫细胞）或组织样本中，可能存在内源性的生物素。这会导致高背景信号。解决方案是使用封闭试剂，在加入荧光链霉亲和素之前，先用无标记的链霉亲和素对细胞进行孵育，以饱和内源性的生物素结合位点。
• 选择高质量的链霉亲和素：选择荧光强度高、背景低的链霉亲和素产品，这对于获得理想的实验结果至关重要。
• 固定剂的影响：某些固定剂（如多聚甲醛）可能会影响某些抗原的表位或生物素-链霉亲和素的结合，需优化条件或选择经验证的配方。

总结