生物素原位杂交如何显色

作者：小编更新时间：2025-11-18

好的，我们来撰写这篇文章。

生物素原位杂交是一项广泛应用于病理学、遗传学和生物学研究的技术，它能精准地在组织切片或细胞涂片上定位特定的DNA或RNA序列。其中，“如何显色”是实验成功的关键环节，直接决定了目标信号能否被清晰观察到。本文将全面解析生物素原位杂交的显色原理、详细步骤、不同显色体系的选择以及常见问题与解决方案。

生物素

生物素原位杂交的显色过程本质上是一个信号放大和转化的级联反应。其核心原理如下：

杂交与标记：首先，使用生物素标记的探针与组织细胞中的靶核酸序列进行特异性结合（杂交）。
桥接与放大：杂交完成后，加入链霉亲和素或卵白素。这两种蛋白质对生物素有极高的亲和力，能特异性地结合到探针的生物素上。
酶促显色：链霉亲和素/卵白素上预先偶联了酶（最常用的是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）。随后，加入该酶的相应底物。酶催化底物发生化学反应，生成不溶性的有色沉淀物，该沉淀物就沉积在靶核酸所在的位置，从而在显微镜下被观察到。

生物素

简单来说，整个过程就是：生物素探针 → 链霉亲和素-酶复合物 → 酶催化底物产生颜色。

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DAB（3,3‘-二氨基联苯胺）显色是其中最经典、最常用的方法，产生棕褐色信号。

阻断内源性过氧化物酶：在加入酶标试剂前，必须用过氧化氢等试剂处理切片，以消除组织自身可能含有的过氧化物酶活性，防止背景染色。
孵育链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物：将切片与SA-HRP溶液共同孵育，使SA-HRP结合到生物素标记的探针上。
DAB显色反应：新鲜配制DAB底物溶液（DAB + 过氧化氢）。将混合液滴加到切片上，在显微镜下监控显色过程。当特异性信号清晰而背景尚浅时，立即将切片浸入水中终止反应。
复染与封片：使用苏木精等染料对细胞核进行浅染（复染），提供组织形态学背景。然后经过脱水、透明，最后用中性树胶封片，以便长期保存和观察。

结果判读：靶核酸所在位置呈现清晰的棕褐色颗粒状或团块状沉淀。

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除了HRP-DAB体系，根据不同的实验需求（如双标、需要红色信号等），还有其他选择：

酶	底物	显色结果	特点
辣根过氧化物酶	AEC	红色	生成酒精溶性红色沉淀，需用水性封片剂，不能长期保存。适合需要红色信号的场合。
碱性磷酸酶	NBT/BCIP	蓝紫色	敏感性高，背景通常较低。产生的蓝紫色信号与红色复染（如核固红）对比鲜明。
碱性磷酸酶	Fast Red

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