生物素怎么连接到探针上

生物素如何连接到探针上？一篇讲清所有标记策略

在分子生物学、诊断检测和生物技术领域，将生物素连接到探针（如DNA、RNA、蛋白质或抗体）上是一个常见且关键的技术。生物素（维生素H）与链霉亲和素之间具有极高的亲和力，这种结合是自然界中最强的非共价相互作用之一。利用这一特性，我们可以通过链霉亲和素上偶联的报告分子（如酶、荧光基团、磁珠）来轻松、灵敏地检测探针。

那么，生物素究竟是如何连接到探针上的呢？其核心方法主要分为化学偶联法和酶促标记法两大类。选择哪种方法取决于探针的类型和具体的实验需求。

一、 化学偶联法

化学偶联法适用于标记合成的寡核苷酸探针、蛋白质、抗体或其他具有特定官能团的分子。该方法的核心是利用生物素衍生物上的活性基团与探针分子上的特定基团发生化学反应，形成稳定的共价键。

常用的生物素衍生物和连接策略包括：

1. 氨基标记：

   • 目标基团： 探针分子上的伯氨基（-NH2），例如DNA/RNA碱基上的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶的氨基，或蛋白质的N-末端及赖氨酸侧链的氨基。
   • 常用生物素试剂： 生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯。
   • 连接原理： NHS酯在弱碱性条件下（pH 7.5-9.0）与伯氨基高效反应，形成稳定的酰胺键，同时释放N-羟基琥珀酰亚胺。
   • 特点： 这是最常用、最成熟的化学标记方法之一，反应效率高，操作相对简单。

2. 巯基标记：

   • 目标基团： 探针分子上的巯基（-SH）。对于蛋白质，通常是半胱氨酸的侧链；对于DNA探针，可在合成时引入带巯基的修饰基团。
   • 常用生物素试剂： 马来酰亚胺基生物素 或 碘乙酰基生物素。
   • 连接原理： 马来酰亚胺基或碘乙酰基与巯基发生特异性烷基化反应，形成稳定的硫醚键。
   • 特点： 特异性强，尤其适用于对氨基标记可能影响生物活性的蛋白质标记。

3. 羧基标记：

   • 目标基团： 探针分子上的羧基（-COOH），例如蛋白质的C-末端或天冬氨酸、谷氨酸的侧链。
   • 常用方法： 使用碳二亚胺类偶联剂（如EDC）进行“零长度”交联。
   • 连接原理： EDC先活化羧基，然后活化的中间体与生物素分子上的氨基反应形成酰胺键。
   • 特点： 这种方法不如氨基标记常用，但在特定情况下有用。

化学偶联法的优缺点：

• 优点： 适用性广，可标记各种类型的分子；标记位置相对灵活；可用于大规模合成标记好的商业化探针。
• 缺点： 反应条件需要优化，可能因探针而异；存在过度标记的风险，可能影响探针的活性或杂交效率；需要纯化步骤以去除未反应的生物素。

二、 酶促标记法

酶促标记法主要用于在体外对DNA或RNA探针进行标记。该方法利用酶的生物催化活性，将带有生物素标记的核苷酸底物掺入到新合成的核酸链中。这种方法特别适合制备长链的、高灵敏度的探针。

1. 缺口平移法

   • 原理： 利用DNA酶I在双链DNA模板上随机制造缺口，再利用DNA聚合酶I的5‘→3’外切酶活性和5‘→3’聚合酶活性，在填补缺口的同时，将反应体系中的生物素-dUTP 掺入到新合成的DNA链中。
   • 特点： 适用于制备长链的双链DNA探针，标记均匀，活性高。

2. 随机引物法

   • 原理： 将变性的DNA模板与随机序列的六核苷酸引物退火。在DNA聚合酶（如Klenow片段）的作用下，以引物为起点合成新的DNA链，并将生物素-dUTP 作为底物掺入。
   • 特点： 标记活性比缺口平移法更高，产生的探针长度相对较短，更适合用于原位杂交。

3. PCR标记法

   • 原理： 在常规PCR反应体系中，将一部分dTTP替换为生物素-dUTP，或者在引物的5‘端预先进行生物素标记。前者会将生物素掺入到整个PCR产物的链中，后者则只在产物的5’末端引入生物素。
   • 特点：
     • 掺入法： 标记效率高，每个DNA分子上标记了多个生物素，信号强。
     • 5‘端标记： 每个DNA分子只标记一个生物素，位置确定，不会影响杂交，常用于需要精确量化或固定化的场景（如微阵列）。

4. 体外转录法（用于RNA探针）

   • 原理： 将目的DNA片段克隆到带有噬菌体启动子（如T7， SP6， T3）的载体中。在相应的RNA聚合酶作用下，以线性化的质粒为模板，进行体外转录，同时将生物素-UTP 掺入到合成的RNA探针中。
   • 特点： 可制备均一、高比活性的单链RNA探针，特别适用于Northern Blot和原位杂交。

酶促标记法的优缺点：

• 优点： 标记效率高，灵敏度好；反应条件温和、标准化；可方便地制备大量探针。
• 缺点： 主要限于核酸探针；需要模板和酶，成本可能较高；掺入法标记的探针长度和标记密度不均一。

三、 如何选择标记方法？

四、 标记后的重要步骤：纯化与验证

无论采用哪种方法，标记反应完成后，去除未掺入的生物素或生物素试剂是至关重要的一步。未反应的生物素会竞争性地结合链霉亲和素，严重降低检测信号的强度和信噪比。常用的纯化方法有：乙醇沉淀、凝胶过滤层析、旋转柱脱盐等。

验证标记是否成功可以通过以下方法：

• 点渍法： 将标记产物和未标记的对照点在膜上，用链霉亲和素-酶结合物和底物进行显色。
• 电泳迁移率变化： 生物素标记的核酸或蛋白与链霉亲和素结合后，在凝胶电泳中的迁移速率会变慢。

总结