微生物法测食品中生物素

微生物法测定食品中生物素：原理、流程与应用全解析

生物素，又称维生素B7或维生素H，是人体新陈代谢中不可或缺的水溶性维生素。它在碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢中扮演着关键角色，尤其在维持皮肤、头发健康以及神经系统功能方面至关重要。因此，准确测定食品中的生物素含量，对于评估食品营养价值、强化食品质量控制以及指导消费者膳食具有重要意义。

在众多检测方法中，微生物法 被国际公认为测定食品中生物素的经典、可靠且高灵敏度的方法。本文将深入解析微生物法的原理、操作步骤、技术要点及其在实际应用中的优劣。

一、为什么选择微生物法？

与高效液相色谱法（HPLC）等化学方法相比，微生物法具有独特的优势：

1. 高灵敏度：能够检测出食品中极其微量的生物素（可达纳克甚至皮克级别）。
2. 高特异性：利用特定微生物的生长需求，结果直接反映具有生物活性的生物素含量，避免了化学法可能无法区分生物素类似物（无活性）的问题。
3. 成本较低：无需昂贵的精密仪器（如质谱仪），实验室设备要求相对简单。
4. 国际标准认可：许多国家和国际组织（如AOAC、中国国标GB 5009.259）均将微生物法作为测定食品中生物素的基准方法。

二、微生物法的核心原理

微生物法的基本原理是：选择一种必须依赖生物素才能生长的微生物菌株，在除生物素外所有营养物都充足的培养基中，该微生物的生长程度与培养基中生物素的含量在一定范围内呈正比关系。

常用的实验菌株：
最常使用的是 阿拉伯乳酸杆菌，也有使用 植物胚芽乳杆菌 等。这些菌株自身不能合成生物素，其生长完全依赖于外界提供的生物素。

定量逻辑：
通过测量微生物生长后的代谢活性（如产酸量）或菌体密度（如浊度），与已知浓度的生物素标准溶液制成的标准曲线进行比较，从而计算出待测样品中生物素的含量。

三、详细操作流程（以阿拉伯乳酸杆菌为例）

整个测定过程严谨而细致，主要步骤包括：

1. 样品前处理：
这是最关键的一步，目的是将食品中结合态的生物素（常与蛋白质结合）完全释放出来，变成游离态，才能被微生物利用。

• 水解：样品需经过酸解、酶解或高压蒸汽处理，以打破生物素与食物基质的结合。
• 提取与净化：水解后的提取液需要进行过滤、调pH值等净化步骤，以去除对微生物生长有抑制作用的杂质。
• 稀释：将提取液稀释到预计的生物素浓度范围，使其落在标准曲线的线性区间内。

2. 培养基制备：
配制不含生物素，但含有碳源、氮源、矿物质和所有其他必需维生素的基础培养基。

3. 标准曲线的制作：

• 准备一系列含有已知浓度梯度生物素的标准溶液（例如：0.0 pg/mL, 5.0 pg/mL, 10.0 pg/mL … 100.0 pg/mL）。
• 将等量的菌种悬浮液接种到每个标准管中。
• 在37°C下恒温培养一定时间（通常为16-24小时）。

4. 样品测定：

• 将处理好的样品提取液，以相同方式接种菌液并培养。

5. 生长指标的测定与计算：

• 滴定法：培养结束后，用标准碱液滴定每个试管中微生物代谢产生的乳酸量，记录消耗的碱液体积。消耗的碱液体积与生物素浓度成正比。
• 光度法：使用分光光度计测量培养液的浊度（通常在600nm波长下），吸光度值与生物素浓度成正比。
• 以标准溶液的生物素浓度为横坐标，测得的滴定体积或吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。最后，根据样品管的测量值，从标准曲线上查得对应的生物素浓度，再乘以稀释倍数，即可计算出原始样品中的生物素含量。

四、技术难点与注意事项

微生物法虽然可靠，但操作技术要求高，需要注意以下几点：

• 无菌操作：整个接种和培养过程必须在无菌条件下进行，任何杂菌污染都会导致实验失败。
• 菌种活力：确保使用的菌种处于最佳生长状态，传代次数过多可能导致菌种退化，影响灵敏度。
• 前处理彻底性：样品水解不完全会导致结果偏低，这是最常见的误差来源。
• 培养基一致性：所有标准管和样品管的培养基成分必须完全一致，确保唯一的生长限制因素是生物素。
• 平行实验：每个样品和标准点都应设置重复，以保证结果的准确性和精密度。

五、方法总结与比较

结论