生物素阻断试剂

作者：小编更新时间：2025-09-16

好的，我们来撰写这篇关于生物素阻断试剂的全面解答文章。

在当今的免疫检测实验（如IHC、ICC、WB、ELISA）中，生物素-链霉亲和素系统因其极高的亲和力而被广泛应用，是放大信号、提高灵敏度的“黄金标准”。然而，许多研究人员都曾遇到一个令人头疼的问题：高背景干扰、非特异性着色，导致结果无法判读。其罪魁祸首，往往就是内源性生物素。

当您搜索“生物素阻断试剂”时，背后是对解决这一棘手问题的迫切需求。本文将深入浅出地为您全面解析生物素阻断试剂，从原理到应用，助您轻松获得清晰可靠的实验结果。

首先，我们要明白干扰从何而来。

在许多组织和细胞中（尤其是肝脏、肾脏、乳腺、脑组织等），天然存在大量的内源性生物素。尤其是在使用富含生物素的饲料喂养动物或某些细胞培养条件下，其水平会更高。

当您使用基于生物素-链霉亲和素的检测系统时：

这种非特异性结合会产生强烈的背景着色，掩盖真正的目标信号，让实验失败告终。而生物素阻断试剂，就是专门设计来解决这个问题的“清道夫”。

生物素阻断试剂的工作原理是一个经典的“预先占位”策略。它通常包含两个步骤、两种试剂：

生物素溶液（Biotin Solution）：
- 首先将游离的、未标记的生物素（通常来源于蛋清）滴加在样本上。
- 这些游离生物素会抢先一步与组织内部所有内源性生物素的结合位点（即后来链霉亲和素要结合的位点）饱和结合。
链霉亲和素溶液（Streptavidin Solution）：
- 随后，加入过量的链霉亲和素溶液。
- 这些链霉亲和素会迅速、彻底地与上一步中已经结合在样本上的游离生物素结合，将所有潜在的结合位点“堵死”。

经过这两步处理后，样本中所有内源性生物素的结合位点都已被“生物素-链霉亲和素”复合物完全占据。当您最后进行正式实验，加入生物素化二抗和标记型链霉亲和素时，标记型链霉亲和素再无多余位点可结合，只能与您特意加入的生物素化二抗特异性结合，从而彻底消除内源性背景。

生物素阻断步骤通常穿插在免疫检测的常规流程中，具体如下：

样本准备：完成石蜡切片脱蜡、水化，或冰冻切片、细胞爬片固定等步骤。
抗原修复：完成必要的抗原修复过程（如需要）。
内源性过氧化物酶阻断：使用3% H₂O₂溶液处理，阻断内源性过氧化物酶（如后续使用HRP系统）。
血清封闭：使用正常血清封闭，减少非特异性抗体吸附。
生物素阻断（关键步骤）：
- 滴加足够的生物素溶液，室温孵育10-20分钟。
- PBS或TBS缓冲液轻轻冲洗。
- 滴加足够的链霉亲和素溶液，室温孵育10-20分钟。
- PBS或TBS缓冲液充分洗涤。
后续实验：继续进行一抗孵育、生物素化二抗孵育、标记链霉亲和素孵育及显色等标准步骤。

注意：不同品牌的试剂盒孵育时间和浓度可能略有差异，请务必参考您所购买产品的说明书。

选择试剂盒：市面上有多种成熟的商品化试剂盒（如Vector Labs的SP-2002，Thermo Fisher等品牌也有提供），通常包含已优化好浓度的生物素和链霉亲和素溶液，方便快捷。您也可以自行配制，但使用商品化试剂能保证结果的稳定性和重现性。
必要性判断：
- 不是所有实验都需要。如果您检测的组织已知内源性生物素含量很低（如许多软组织），或实验中没有背景问题，则可以省略此步骤。
- 建议设置阴性对照（不加一抗）和生物素阻断对照（一组做阻断，一组不做），来确证背景干扰确实来自内源性生物素，并验证阻断效果。
重要注意事项：
- 顺序绝不能错：必须是先加游离生物素，再加链霉亲和素。顺序颠倒将完全无效。
- 充分洗涤：两步之间的洗涤非常重要，避免残留试剂影响下一步。
- 兼容性：该方法是用于阻断链霉亲和素系统的背景。如果您使用的是亲和素（Avidin），则需要使用亲和素-生物素阻断试剂（通常包含亲和素和生物素），因为亲和素和链霉亲和素在等电点等方面有差异。

Q1: 做了生物素阻断后，目标信号也变弱了是怎么回事？
A: 这通常不是因为阻断试剂破坏了您的目标蛋白或抗体。更可能的原因是您的检测信号本身非常微弱，而高背景在视觉上“衬托”出了假信号。阻断背景后，真实的弱信号就显现出来了。此时应考虑优化一抗浓度或采用更灵敏的检测方法放大信号。

Q2: 可以只用生物素，不用链霉亲和素吗？
A: 不可以。游离生物素与内源性生物素结合位点的结合是可逆的，在后续步骤中可能会被高亲和力的标记链霉亲和素（来自您的检测系统）竞争下来。必须用链霉亲和素将其永久“封堵”才行。

Q3: 生物素阻断试剂会影响一抗或二抗的结合吗？
A: 不会。生物素阻断试剂只针对样本中内源的生物素及其结合位点，与抗体及其靶抗原没有相互作用，不会影响特异性免疫结合反应。

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