生物素阻断亲和素

生物素阻断（亲和素阻断）完全指南：原理、步骤与问题解答

在免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）或ELISA等利用生物素-亲和素系统（BAS）的实验中，研究人员常常会遇到一个令人困扰的问题：高背景染色、非特异性信号，从而导致结果不准确。此时，“生物素阻断”或“亲和素阻断”便成为了解决这些问题的关键步骤。如果您正在搜索这个关键词，您的需求可能主要集中在以下几个方面：为什么需要阻断？如何正确进行操作？以及遇到问题时该如何解决？ 本文将为您全面解析。

一、 核心需求解析：为什么要进行生物素阻断？

生物素-亲和素系统因其具有超高亲和力（Ka≈10^15 M⁻¹），被誉为“天然级放大系统”，被广泛应用于增强检测信号。然而，这种强大的结合能力也是一把“双刃剑”，正是内源性生物素的存在导致了问题的出现。

1. 内源性生物素的干扰：
   许多组织和细胞（如肝脏、肾脏、乳腺、脂肪组织、线粒体丰富的细胞等）天然含有生物素。在实验过程中，这些内源性生物素会与外源添加的链霉亲和素（Streptavidin）或亲和素（Avidin） 探针直接结合，从而产生强烈的非特异性背景染色，掩盖了真正的目标信号。

2. 亲和素的非特异性结合：
   亲和素是一种碱性糖蛋白（pI ~10.5），在某些情况下会与组织中的阴离子基团（如磷脂）发生非特异性离子结合，进一步增加背景。

因此，生物素阻断的目的就是为了预先饱和组织切片或细胞样本中的内源性生物素结合位点，防止后续实验步骤中标记的亲和素/链霉亲和素与之结合，从而获得干净、特异、可信的实验结果。

二、 核心需求解析：如何进行生物素阻断？——标准操作流程

生物素阻断通常在一抗孵育之后、生物素标记的二抗（或探针）孵育之前进行。以下是经典的两步法操作步骤：

【实验前准备】

• 阻断试剂：需要准备两种溶液：
  • 亲和素溶液（Avidin Solution）：用于封闭内源性生物素。
  • 生物素溶液（Biotin Solution）：用于封闭亲和素上剩余的结合位点。
  • （请注意：市面上有成熟的即用型内源性生物素阻断试剂盒，包含A液和B液，非常方便。）

【操作步骤】

1. 样本准备：按标准流程对石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复，或对冰冻切片、细胞爬片进行固定、透化等处理。
2. 灭活内源性过氧化物酶（如需进行HRP显色）和血清封闭（阻断Fc受体非特异性结合）。
3. 孵育一抗：滴加适量的一抗，湿盒中孵育后，PBS或TBS冲洗。
4. 第一步阻断：亲和素孵育
   • 滴加足够覆盖样本的亲和素溶液（或商品化试剂盒中的A液）。
   • 室温孵育 15-20分钟。
   • 用PBS或TBS充分洗涤切片（建议3次，每次5分钟）。
5. 第二步阻断：生物素孵育
   • 滴加足够覆盖样本的生物素溶液（或商品化试剂盒中的B液）。
   • 室温孵育 15-20分钟。
   • 用PBS或TBS充分洗涤切片（建议3次，每次5分钟）。
6. 后续实验：继续孵育生物素标记的二抗，然后进行ABC或SP复合物孵育、显色、复染、封片等标准步骤。

三、 核心需求解析：常见问题与解决方案（FAQ）

1. 问：为什么我已经做了阻断，背景还是很高？

   • 原因分析：
     • 阻断不充分：内源性生物素含量极高，常规阻断时间或浓度不足。
     • 一抗或二抗的非特异性结合：高背景可能并非来自内源性生物素，而是抗体本身引起的。
     • 亲和素/链霉亲和素探针浓度过高。
   • 解决方案：
     • 优化阻断：适当延长两步阻断的孵育时间（例如延长至30分钟），或尝试在4℃下过夜孵育。
     • 设置对照：设立阴性对照（不加一抗）和生物素阻断对照（不加一抗但进行阻断步骤），帮助准确判断背景来源。
     • 降低探针浓度：尝试降低生物素标记二抗或ABC/SP复合物的稀释浓度。

2. 问：阻断步骤会导致目标信号减弱吗？

   • 理论上不会。生物素阻断使用的是游离的小分子生物素，它只会占据内源性生物素的位点和亲和素上剩余的少量位点。后续添加的生物素标记二抗携带的是大量的生物素分子，足以完全饱和ABC或SP复合物上的多个结合位点，从而产生强大的信号放大效应，不会导致目标信号显著减弱。

3. 问：所有实验都必须做生物素阻断吗？

   • 不是。只有当您使用的组织已知含有高水平内源性生物素，并且在预实验或阴性对照中观察到了疑似内源性生物素引起的背景染色时，才需要进行此项操作。对于内源性生物素含量很低的组织，此步骤可以省略。

4. 问：除了化学阻断，还有其他方法吗？

   • 有。
   • 使用链霉亲和素替代亲和素：链霉亲和素（Streptavidin）近乎中性（pI ~6.8-7.5），非特异性离子结合远低于亲和素，是更优的选择。
   • 使用非生物素检测系统：从根本上避免问题，例如直接使用HRP或ALP标记的一抗，或采用Polymer聚合物检测系统（如EnVision™），这些系统不依赖生物素-亲和素系统，完全避免了内源性生物素的干扰。

四、 总结

生物素（亲和素）阻断是一项简单却至关重要的实验技术，是确保基于BAS的实验结果特异性和准确性的关键。成功的关键在于：

• 准确判断：通过设置对照确定背景是否来源于内源性生物素。
• 规范操作：严格按照两步法的顺序和充分的洗涤步骤进行。
• 灵活优化：根据特定组织类型调整阻断时间和浓度。