双氮生物素

双氮生物素：定义、应用与使用指南

什么是双氮生物素？

双氮生物素（Diazirine Biotin）是一种交叉链接剂和标记试剂，结合了光反应性双氮丙啶基团和生物素标签。生物素，又称维生素B7或维生素H，以其与链霉亲和素和亲和素的高亲和力结合而闻名，使其成为生物检测和纯化系统中的强大工具。双氮丙啶基团在紫外线照射下产生高反应性卡宾中间体，这些中间体可以与附近的分子形成共价键，从而实现稳定交联。

这种化合物的全名通常包括其可切割或不可切割的链接臂，例如“LC-LC-Diazirine-Biotin”或“Sulfo-SDAD-Biotin”，其中“LC”代表长链，“Sulfo”表示水溶性磺化形式。双氮丙啶生物素主要用于蛋白质组学研究、蛋白质-蛋白质相互作用研究、细胞表面标记和亲和纯化。

双氮生物素的特性和优势

双氮生物素结合了光亲和标记和生物素-亲和素技术的最佳特性，提供以下关键优势：

1. 高效标记：双氮丙啶基团在紫外线照射下（通常为330-370 nm）产生高反应性卡宾，这些卡宾可以插入C-H、N-H和O-H键，实现与各种生物分子的高效交联。
2. 高灵敏度检测：生物素部分允许使用链霉亲和素或亲和素结合物（如辣根过氧化物酶或荧光染料标记的链霉亲和素）进行高灵敏度检测。
3. 多功能链接臂：许多商业版本提供可切割（例如，二硫键）或不可切割的链接臂，以及长链链接臂以减少空间位阻，提高可及性。
4. 水溶性选项：磺化形式（如Sulfo-SDAD-Biotin）具有水溶性，适用于水性缓冲液中的标记实验，无需有机溶剂。

双氮生物素的主要应用领域

1. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：双氮生物素用于研究蛋白质复合物。一种蛋白质可以用双氮生物素标记，紫外线照射后，与相互作用的蛋白质交联。然后使用链霉亲和素珠纯化交联复合物，并通过质谱或Western blotting进行分析。
2. 细胞表面标记和蛋白质组学：双氮生物素可用于标记细胞表面蛋白质。由于双氮丙啶基团是光活化的，它可以用于在特定时间点捕获细胞表面蛋白质组，提供动态过程的快照。
3. 亲和纯化和检测：生物素部分允许使用链霉亲和素包被的磁珠或琼脂糖珠高效纯化交联复合物。纯化后的复合物可以用于下游应用，如Western blotting、质谱分析或ELISA。
4. 活细胞成像：结合荧光标记的链霉亲和素，双氮生物素可以用于成像研究，可视化特定蛋白质或复合物在细胞中的定位。

如何使用双氮生物素？

使用双氮生物素进行实验通常涉及以下步骤：

1. 样品制备：准备蛋白质样品、细胞或细胞裂解液。对于细胞实验，确保细胞健康并在适当的缓冲液中。
2. 标记：将双氮生物素添加到样品中。浓度和孵育时间可能因具体应用而异。对于水不溶性版本，可能需要先用DMSO溶解，再稀释到缓冲液中。
3. 光活化：用紫外线（~350 nm）照射样品以激活双氮丙啶基团。照射时间通常为几分钟到半小时，具体取决于实验设置。
4. 淬灭和裂解：停止反应并通过添加淬灭剂（如含有还原剂的裂解缓冲液）来裂解细胞（如果适用）。
5. 亲和纯化：使用链霉亲和素珠孵育裂解液，捕获生物素化分子。充分洗涤以去除非特异性结合。
6. 洗脱和分析：对于可切割生物素（如二硫键连接的），可以用还原剂（如DTT）洗脱。对于不可切割版本，可以使用变性条件洗脱。洗脱的样品可以用于SDS-PAGE、Western blotting或质谱分析。

如何选择适合的双氮生物素产品？

选择双氮生物素时，请考虑以下因素：

• 可切割性与不可切割性：如果您需要从链霉亲和素珠上温和洗脱交联复合物，请选择带有二硫键等可切割链接臂的产品。否则，不可切割版本可能更简单。
• 链接臂长度：长链链接臂（如LC-LC-Diazirine-Biotin）可以减少空间位阻，提高标记效率，特别是对于埋藏的位点。
• 水溶性：对于细胞实验或在水性缓冲液中工作，磺化形式（如Sulfo-SDAD-Biotin）是理想的选择，因为它不需要有机溶剂。
• 制造商和纯度：从 reputable供应商（如Thermo Fisher、Sigma-Aldrich、TOKYO CHEMICAL INDUSTRY等）选择高纯度产品，以确保实验的一致性和可重复性。

注意事项与常见问题

• 光敏感性：双氮生物素对光敏感，应在避光条件下处理和储存，以防止提前活化。
• 紫外线照射优化：紫外线照射条件（波长、时间、强度）需要优化，以平衡交联效率与细胞损伤或蛋白质变性。
• 控制实验：始终包含适当的对照，例如没有紫外线照射或没有双氮生物素的样品，以区分特异性交联与非特异性结合。
• 生物素本底：请注意，细胞培养基中通常含有生物素，可能会干扰实验。必要时使用无生物素培养基。

结论