96微孔板测生物素步骤

96微孔板生物素（Biotin）检测完整指南：从原理到数据分析

在生命科学研究和体外诊断领域，使用96微孔板（即酶标板）进行生物素检测是一项常见且关键的技术。无论您是初次接触该实验的新手，还是希望优化实验流程的研究人员，本指南将为您提供一份从原理、试剂准备、详细步骤到结果分析的完整方案。

一、 实验原理：基于亲和素的酶联免疫吸附法

目前最常用的96微孔板生物素检测方法本质上是基于链霉亲和素-生物素系统（Streptavidin-Biotin System, SBS）的酶联免疫吸附法（ELISA）。

其核心原理是利用生物素（Biotin） 与链霉亲和素（Streptavidin） 之间超高亲和力（KD ~10^-15 mol/L）和高度特异性的结合。简单来说：

1. 在微孔板孔内预先包被有链霉亲和素。
2. 加入待测样品，样品中的生物素会与板上的链霉亲和素特异性结合。
3. 加入标记有酶（如HRP辣根过氧化物酶或ALP碱性磷酸酶）的生物素类似物（酶标生物素）作为检测分子。
4. 洗涤后，加入酶的相应底物（如TMB），酶催化底物发生显色反应。
5. 颜色的深浅与样品中生物素的含量成正相关，通过酶标仪测定吸光度值（OD值），即可定量计算出样品中生物素的浓度。

二、 实验前的准备工作

1. 主要试剂与耗材：

• 96孔微孔板： 预先包被链霉亲和素的板子是商业试剂盒的标准配置，无需自行包被。
• 标准品： 已知浓度的生物素标准品溶液，用于绘制标准曲线。通常有6-7个浓度梯度。
• 待测样品： 血清、血浆、细胞培养上清液、食品提取液等。样品可能需要适当的稀释和预处理。
• 酶标生物素： 即生物素标记的酶（HRP-Biotin）。
• 洗涤缓冲液（Wash Buffer）： 通常是含0.05% Tween-20的PBS或Tris-HCl缓冲液。
• 底物溶液（Substrate Solution）： 对于HRP，常用TMB（四甲基联苯胺），显色为蓝色，终止后变为黄色。
• 终止液（Stop Solution）： 对于TMB，常用1M或2M的硫酸或盐酸。
• 酶标仪： 能检测450nm（TMB终止后）波长的设备。

2. 样品预处理：

• 对于复杂样品（如血清、组织匀浆），可能需要离心去除沉淀物。
• 重要提示： 样品中生物素的浓度可能远高于线性范围，实验前务必进行预实验摸索最佳稀释倍数，并使用稀释液（通常是标准品稀释液或PBS）进行稀释。

三、 详细操作步骤（以商业试剂盒为例）

注意： 不同品牌的试剂盒操作可能略有差异，请务必以您所用试剂盒的说明书为准。以下为通用流程。

第一步：试剂准备

1. 将所有试剂、样品和标准品从冰箱取出，室温平衡30分钟。
2. 配制所需浓度的标准品：按要求用稀释液倍比稀释，生成标准曲线点（如0, 2.5, 5, 10, 20, 40 ng/mL）。
3. 根据需要配制洗涤缓冲液（如果提供的是浓缩液）。
4. 将待测样品进行适当稀释。

第二步：加样与孵育

1. 设置孔位：建议设置标准品孔、待测样品孔、空白孔（仅加稀释液）。
2. 加入标准品和样品：取100μL不同浓度的标准品或已稀释的样品加入相应孔中。
3. 覆盖板贴，在37℃下孵育90-120分钟（具体时间见说明书）。

第三步：洗涤

1. 小心揭掉板贴，弃去孔内液体。
2. 每孔加满洗涤缓冲液（约350μL），静置30秒后弃去，在吸水纸上拍干。
3. 重复洗涤过程4次。充分的洗涤是降低背景、提高信噪比的关键。

第四步：加酶与孵育

1. 除空白孔外，每孔加入新鲜稀释的酶标生物素工作液100μL。
2. 覆盖新的板贴，在37℃下孵育60分钟。

第五步：洗涤

1. 弃去孔内液体。
2. 再次重复第四步的洗涤过程4-5次，确保彻底洗净未结合的酶标记物。

第六步：显色

1. 每孔（包括空白孔）加入底物TMB溶液90μL。
2. 在37℃下避光孵育15-30分钟。期间观察标准品高阶浓度孔是否出现明显的蓝色。

第七步：终止与检测

1. 当高阶浓度孔显色明显且梯度良好时，每孔加入终止液50μL。溶液颜色立即由蓝变黄。
2. 在加入终止液后的15分钟内，用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度（OD值）。

四、 数据处理与分析

1. 计算平均值： 计算标准品和样品复孔的平均OD值。
2. 绘制标准曲线：
   • 以标准品浓度的对数值（log）为X轴，以对应的平均OD值为Y轴。
   • 使用软件（如Excel）生成四参数 logistic (4-PL) 拟合曲线，这是ELISA分析中最准确的拟合方式。
3. 计算样品浓度：
   • 将样品的平均OD值代入标准曲线方程，计算出对应的浓度。
   • 切记： 计算出的浓度必须再乘以样品的稀释倍数，才能得到原始样品中的真实浓度。

五、 常见问题与解决方案

• 标准曲线线性差（R²<0.99）： 检查标准品稀释是否准确，孵育时间温度是否均匀，酶标生物素是否失效。
• 信号值偏低或无信号： 检查试剂是否过期，孵育步骤是否遗漏，洗涤是否过于剧烈导致复合物洗脱。
• 背景过高（所有孔都显色很深）： 最可能的原因是洗涤不充分，未结合的成分残留。其次检查底物是否被污染或孵育时间过长。
• 复孔间差异大： 确保加样操作精准，使用校准过的移液器和吸头，避免产生气泡。

六、 注意事项

• 全程戴手套，防止人皮肤表面的生物素污染实验，导致背景极高。
• ‍严格控制各步骤的孵育时间和温度。
• ‍使用高质量的移液器和吸头，保证加样准确性。
• ‍TMB底物对光敏感，显色步骤需避光操作。
• 阅读说明书！阅读说明书！阅读说明书！