饲料生物素高效液相测定

饲料中生物素含量高效液相色谱（HPLC）测定方法详解

生物素作为畜禽及水产动物生长发育所必需的维生素，在饲料中的含量直接影响动物的健康与生产性能。高效液相色谱法（HPLC）因其高灵敏度、高准确性和良好的重复性，已成为饲料中生物素含量测定的主流方法。本文将系统介绍基于HPLC的饲料生物素测定全过程。

一、方法原理

利用高效液相色谱仪，经C18色谱柱进行分离，通过紫外检测器或荧光检测器进行检测。样品经过前处理提取和净化后，生物素在特定波长下产生吸收或发射荧光，通过保留时间定性，峰面积外标法定量。

二、实验步骤

1. 样品前处理

• 提取：精确称取适量饲料样品（约2-5g），加入50mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=6.0)，于121℃高压水解30分钟，冷却后定容至刻度，过滤。
• 酶解：取部分滤液，加入适量淀粉酶和蛋白酶，于37℃水浴中酶解4小时，使结合态生物素转化为游离态。
• 净化：使用C18固相萃取小柱对酶解液进行净化，收集洗脱液，经0.45μm微孔滤膜过滤后待测。

2. 色谱条件

• 色谱柱：C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）
• 流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液（pH=4.5）（15:85，v/v）
• 流速：1.0mL/min
• 柱温：30℃
• 检测波长：210nm（紫外检测器）
• 进样量：20μL

3. 标准曲线绘制

配制系列浓度的生物素标准工作液（0.05、0.1、0.5、1.0、2.0μg/mL），按上述色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

4. 样品测定与计算

将处理好的样品溶液注入液相色谱仪，根据保留时间定性，峰面积定量，通过标准曲线计算样品中生物素含量。

三、注意事项

1. 样品前处理：饲料样品中生物素存在形式复杂，需通过高温高压和酶解处理使结合态生物素完全释放，这是保证测定准确性的关键。
2. 色谱柱选择：建议使用专为维生素分析设计的C18色谱柱，以获得更好的分离效果和峰形。

• 流动性调整：根据实际色谱行为适当调整流动相比例和pH值，优化分离度。

3. 方法验证：开展加标回收实验验证方法准确性，回收率一般应控制在85%-115%之间。
4. 质量控制：每批样品分析应同时带标准品和空白对照，确保仪器状态稳定和结果可靠。

四、方法优势与局限性

HPLC法测定饲料中生物素含量具有灵敏度高（检测限可达0.01mg/kg）、特异性好、准确性高等优点，能够满足各类饲料产品的检测需求。但该方法前处理过程较为复杂，对操作人员技术要求较高，且仪器设备投资较大。

本方法完全符合《GB/T 17812-2008 饲料中维生素B6、维生素B12和生物素的测定 高效液相色谱法》等国家标准要求，适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中生物素含量的测定。